Latest revision as of 18:59, 27 October 2020

Experiments

The details about our experimental protocols

This page is about our protocols, you can find all the experimental process you need.
Enjoy!

Congo red Assay

Materials:

Equipment:

1. Pipette and pipette tips

2. Centrifuge

3. ELISA reader

4. Incubator

5. 96 well plate

6. Centrifuge tube

Consumables:

1. Congo red

2. IPTG

3. LB

4. ddH₂O

Protocol:

1. Culture bacteria NOS-DA-BL21, BW25113 csgD, BW25113 control for 2hr.

2. Add IPTG for induce for 12hr.

3. Adjust OD to 1.

4. Add congo red 3μl to 1ml bacteria.

5. Wait 2hr.

6. Centrifuge full speed 2min.

7. Remove supernatant.

8. Add 1 ml water.

9. Put 200μl into 96 well plate.

10. Air dry.

11. Add water 200μl.

12. Wait 20 min.

13. Remove water.

14. Add water 200μl.

15. Test OD ₅₀₀

Biofilm Assay

Materials:

Equipment:

1. Pipette and pipette tips

2. Centrifuge

3. ELISA reader

4. Incubator

5. 96 well plate

6. Centrifuge tube

Consumables:

1. IPTG

2. LB

3. ddH₂O

Protocol:

1. Culture bacteria NOS-DA-BL21, BW25113 csgD, BW25113 control for 2hr.

2. Add IPTG for induce for 12hr.

3. Adjust OD to 1.

4. Add congo red 3μl to 1ml bacteria.

5. Wait 2hr.

6. Centrifuge full speed 2min.

7. Remove supernatant.

NOS Kinetic Test

Materials:

Equipment:

1. Pipette and pipette tips

2. Centrifuge

3. ELISA reader

4. Incubator

5. 96 well plate

6. Centrifuge tube

Consumables:

1. NOS kit

2. IPTG

3. LB

4. ddH₂O

Protocol:

Preparation:

1. Culture bacteria (NOSDA BL21) 3ml for 13 hr.

2. Adjust OD to 1.

3. Add IPTG 0.1 one hr.

4. Sonication.

5. Put 60μl of cell (NOSDA BL21) into 96well.

NOS assay:

1. Prepare 40μl reaction mix for each well.

Components	Volume (μl)
NOS cofactor 1	10
NOS cofactor 2	20
Substrate	5
Nitrate reductase	5
Total Volume	40

2. Add 40μl reaction mix for each well by 0, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 min.

3. Incubate 10 mins 37^oC.

4. Add 95μl NOS assay buffer to each well.

5. Add 5μl enhancer to each well.

6. Incubate room temperature 10mins.

7. Add 50μL reagent 1 and 50μL reagent 2 to each well.

8. Incubate for 10 mins.

9. Measure OD₅₄₀.

IPTG Induce NOS Test

Materials:

Equipment:

1. Pipette and pipette tips

2. Pipette and pipette tips

3. Centrifuge

4. ELISA reader

5. Incubator

6. 96 well plate

7. Centrifuge tube

Consumables:

1. NOS kit

2. IPTG

3. LB

4. ddH₂O

Protocol:

Preparation:

1. Culture bacteria (NOSDA BL21) 3ml for 12 hr.

2. Adjust OD to 0.5.

3. Add IPTG with different time (0.025mM, 0.05mM, 0.1mM) and concentration (0.5hr, 1hr, 1.5hr).

4. Sonication.

NOS assay kit:

1. Put 60μl of cell (NOSDA BL21) into 96well.

2. Prepare 40μl reaction mix for each well.

Components	Volume (μl)
NOS cofactor 1	10
NOS cofactor 2	20
Substrate	5
Nitrate reductase	5
Total Volume	40

3. Add 40μl reaction mix for each well by 0, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 min.

4. Incubate 10 mins 37^oC.

5. Add 95μl NOS assay buffer to each well.

6. Add 5μl enhancer to each well.

7. Incubate room temperature 10mins.

8. Add 50μL reagent 1 and 50μL reagent 2 to each well.

9. Incubate for 10 mins.

10. Measure OD₅₄₀.

LB Preparation

Materials:

Equipment:

1. Glass bottle (for LB broth) or Erlenmeyer flask (for agar medium)

2. Magnetic stirrer

3. Magnetic stirring bar

4. Plastic measure jug

5. Measure cylinder

6. Spoon

7. Petri dish (for agar medium)

8. Aluminum foil

9. Electronic balance

10. Weighing paper or weighing bowl

11. Pipette and pipette tips

Consumables:

1. DW (distilled water)

2. Tryptone

3. Yeast extract

4. NaCl

5. NaOH (10N)

6. Agar (for LB agar)

7. Antibiotics (for selection plate)

Protocol:

1. Prepare mixture as the following inside a jar with a magnetic stirring bar inside and place it on the magnetic stirrer.

Components	Amount
DW	98 ml
Tryptone	1 g
Yeast Extract	0.5 g
NaCl	1 g
NaOH (10N)	20 μl
Total Volume	100 ml
Agar (for LB agar)	1.50%

2. Mix well, pour the mixture into the bottle or flask and autoclave. Notes: For agar medium, pour the mixture to the petri dish and dry the plates.

For selection plates, add antibiotics as the following before pouring the mixture to the petri dish:

Kanamycin: 100 μl/100 ml media

Chloramphenicol: 50 μl/100 ml media

Ampicillin: 100 μl/100 μl media

Competent Cell Preparation

Protocol:

Equipment:

1. Glass bottle (for LB broth) or Erlenmeyer flask (for agar medium)

2. Magnetic stirrer

3. Magnetic stirring bar

4. Plastic measure jug

5. Measure cylinder

6. Spoon

7. Petri dish (for agar medium)

8. Aluminum foil

9. Electronic balance

10. Weighing paper or weighing bowl

11. Pipette and pipette tips

Consumables:

1. CaCl₂

2. Glycerol

3. LB

4. ddH₂O

Protocol:

Culture bacteria for making competent cell:

1. Add 6mL LB into the test tube.

2. Pick one colony from the plate and add it into the test tube.

3. Culture O.N. 37C, 200 rpm.

Test O.D. value & make competent cell:

1. Add 1mL overnight bacterial culture to 50mL LB.

2. When the O.D. is about 0.3~0.4, centrifuge 5000 rpm, 10 mins, discard the supernatant.

3. Resuspend the bacteria pellet in 25 ml ice cold 100 mM CaCl₂ solution for 30 minutes on ice. Centrifuge the cell suspension at 5000 rpm in the Sorvall GSA rotor for 10 minutes. Discard the supernatant.

4. Resuspend the bacteria pellet on ice in 1ml of ice cold 100 mM CaCl₂/15% glycerol (sterile) in each.

5. Dispense the bacteria in 100 mL aliquots (on ice) to 10 eppendorf.

6. Freeze cells at -80^oC.

Standard PCR

Materials:

Equipment:

1. PCR tubes

2. Ice bucket

3. Thermocycler

4. Pipette and pipette tips

Consumables:

1. MQ or ddH₂O

2. 2x PCR buffer for KOD FX

3. dNTPs 2 mM

4. Forward and reverse primer (10 μM)

5. KOD FX polymerase

Protocol:

1. Prepare 40μl reaction mix for each well.

Components	Volume (μl)
MQ or ddH₂O	1.1
10x PCR buffer	1
dNTP 2.5 mM	0.8
Template	1
Forward primer 10 μM	1
Reverse primer 10 μM	0.1
Taq polymerase + vent	0.1
Total Volume	10

2. Gently mix the PCR reactions and centrifuge briefly.

3. Transfer the PCR tubes to a thermocycler.

step	Temperature	Time
Initial denaturalization	94°C	2 mins
25 - 35 cycles	98°C (denaturation)	30 secs
	55°C (annealing)	30 secs
	68°C (extension)	2 mins (depend on sequence size 2kbp/min.)
Final Extension	68°C	2 mins
Hold	16°C (holding for a short time) or 4°C (holding for a long time)	∞

PCR Clean-up

Materials:

Equipment:

1. Eppendorf tubes

2. Collection tubes

3. Spin column

4. Pipette and pipette tips

5. Centrifuge

Consumables:

1. Isopropanol

2. Binding buffer

3. Washing buffer

4. Elution buffer

5. MQ or ddH₂O

Protocol:

DNA binding:

1. Add MQ or ddH₂O to DNA solution until the volume reaches 100 μl.

2. Add 300 μl of binding buffer to the solution.

3. Add 150 μl of isopropanol and invert the eppendorf 10 times.

4. Place a spin column in a provided collection tube. Transfer 550 μl sample to the spin column and centrifuge for 30 secs, 12,000 rpm.

5. Discard flow-through and place the spin column back into the collection tube.

Wash

1. Add 500 μl of washing buffer to the spin column and centrifuge for 30 secs, 12,000 rpm.

2. Discard flow-through and place the spin column back into the collection tube.

3. Add 200 μl of washing buffer to the spin column and centrifuge for 5 mins, 12,000 rpm.

4. Discard flow-through and place the spin column back into the collection tube.

DNA elution

1. Transfer spin column to clean eppendorf. Add 50 μl of elution buffer to the spin column. Centrifuge for 2 mins, 12,000 rpm.

2. Collect the pure sample in the eppendorf and discard the spin column.

3. Keep the DNA solution in -20°C freezer.

Restriction Enzyme Digestion

Restriction Enzymes	Buffer (Buffer will depend on restriction enzyme being used)
EcoRI	SuR E/Cut Buffer H (10X) - Roche
XbaI	CutSmart Reaction Buffer (10x) - NEB or 3.1 - NEB
SpeI	CusSmart Reaction Buffer (10x) - NEB
PstI	3.1 (10X) - NEB

Materials:

Equipment:

1. Eppendorf tubes

2. Pipette and pipette tips

3. Ice bucket

4. Incubator (37°C)

Consumables:

1. Restriction enzymes

2. Buffer 10x (depends on its restriction enzymes)

3. DNA sample

4. MQ od ddH₂O (for single digestion)

Protocol:

1. On the ice, add all the components.

Double Digestion:

Total Volume	20 μl
DNA	15 μl
Buffer 10x	3 μl
Restriction enzyme 1	1 μl
Restriction enzyme 2	1 μl

Single Digestion (Structure Check):

Total Volume	15 μl
Plasmid DNA	2 μl
Buffer 10x	1.5 μl
Restriction enzyme	0.5 μl
MQ or ddH₂O	11 μl

2.Mix gently and incubate for 1-2 hours for double digestion or 30 mins - 1 hour for single digestion at 37°C. Note: Incubation time varies along the total volume of the reaction.

Gel Extraction and Purification

Materials:

Equipment:

1. Eppendorf tubes

2. Collection tubes

3. Spin column

4. Pipette and pipette tips

5. Centrifuge

6. Scalpel

7. Dry Thermounit

Consumables:

1. Isopropanol

2. Binding buffer

3. Washing buffer

4. Elution buffer

Protocol:

Gel excision, solubilization and DNA binding:

1. Excise band with scalpel and transfer to a new eppendorf tube.

2. Weigh the gel slice in a tube (by measuring the weight difference of an empty eppendorf and the eppendorf with gel slice in the tube).

3. Add 3 volumes of binding buffer to 1 volume of gel (100 mg = 100 μl).

4. Incubate at 60°C for 2-10 mins (or until the gel has completely dissolved).

5. Add 1.5 volume of isopropanol and invert the eppendorf 10 times.

6. Place a spin column in a provided collection tube. Transfer 700 μl sample to the spin column and centrifuge for 30 secs, 12,000 rpm.

7. Discard flow-through and place the spin column back into the collection tube.

2. Wash:

1. Add 500 μl of washing buffer to the spin column and centrifuge for 30 secs, 12,000 rpm.

2. Discard flow-through and place the spin column back into the collection tube.

3. Add 200 μl of washing buffer to the spin column and centrifuge for 5 mins, 12,000 rpm.

4. Discard flow-through and place the spin column back into the collection tube.

3. DNA elution:

1. Transfer spin column to clean eppendorf. Add 50 μl of elution buffer to the spin column. Centrifuge for 2 mins, 12,000 rpm.

2. Collect the pure sample in the eppendorf and discard the spin column.

Keep the DNA solution in -20°C freezer.

Ligation

Materials:

Equipment:

1. Eppendorf tubes

2. Pipette and pipette tips

3. Centrifuge

Consumables:

1. T4 DNA ligase (NEB)

2. T4 DNA ligase buffer (NEB)

Protocol:

1. Prepare 40μl reaction mix for each well.

Components	Volume (μl)
Vector DNA	12
Insert DNA	40
Fast Ligase 2X buffer	5.8
T4 ligase	0.5
Total Volume	58.3

2. Gently mix the reaction and centrifuge.

3. Incubate at 16°C overnight.

4. Keep the DNA solution in -20°C freezer.

Colony PCR

Materials:

Equipment:

1. PCR tubes

2. Ice

3. Thermocycler

4. Pipette and pipette tips

Consumables:

1. MQ or ddH₂O

2. 10x PCR buffer

3. dNTPs 2.5 mM

4. Forward and reverse primer (10 μM)

5. Taq polymerase with 3 μl vent

Protocol:

1. On ice, add all components in a PCR tube, making up to 50 µl volume reaction.

Components	Volume (μl)
MQ or ddH₂O	1.1
10x PCR buffer	1
dNTP 2.5 mM	0.8
Template	1
Forward primer 10 μM	1
Reverse primer 10 μM	0.1
Taq polymerase + vent	0.1
Total Volume	10

2. Gently mix the PCR reactions and centrifuge briefly.

3. Transfer the PCR tubes to a thermocycler.

step	Temperature	Time
Initial denaturalization	94°C	5 mins
25 - 35 cycles	94°C (denaturation)	30 secs
	55°C (annealing)	30 secs
	72°C (Extension)	2 mins (depend on sequence size 2kbp/min.)
Final Extension	72°C	5 mins
Hold	16°C (holding for a short time) or 4°C (holding for a long time)	∞

Bacterial Glycerol Stock

Materials:

Equipment:

1. Pipette and pipette tips

2. Cryovial

Consumables:

1. 50% glycerol (autoclaved)

2. Bacterial overnight culture with an antibiotic if necessary

Protocol:

1. Put 1 ml of bacterial overnight culture into the cryovial and add 500 μl of 50% glycerol. Mix it well.

2. Keep it in the -80°C freezer.

SDS-PAGE

Materials:

Equipment:

1. Eppendorf tubes

2. Pipette and pipette tips

3. Centrifuge

4. Vortex

5. Ice bucket

6. Empty box

7. Dry Thermounit

8. Glass plates

9. 10-well comb

10. Spacer

11. Clamp

12. Casting stand

13. Buffer tank

14. Voltage source

15. Shaker

Consumables:

1. H₂O

2. 30% acrylamide

3. 1.5M tris pH 8.8

4. 1M tris pH 6.8

5. 10% SDS

6. 10% APS

7. TEMED

8. Prestained Protein Marker - Bioman

9. Protein dye

10. Overnight culture (sample)

11. Coomassie Brilliant Blue (CBB) staining solution

12. Destaining buffer

13. Tank buffer (1X)

14. Isopropanol

Protocol:

Resolving gel preparation:

1. Adjust the amount of agarose to get the desired gel concentration.

2. In a 50 ml eppendorf tube add all the components 15% gel concentration.

Total Volume	5 ml	10 ml	15 ml
H2O (ml)	1.15	2.3	3.4
30% acrylamide mix (ml)	2.5	5	7.5
1.5M Tris pH 8.8 (ml)	1.25	2.5	3.3
10% SDS (ml)	0.05	0.1	0.15
10% APS (ml)	0.1	0.2	0.3
TEMED (ml)	0.002	0.004	0.006

3. Pour the mixture in between the glasses and add iso-propanol afterward.

4. Wait for 10-15 mins or until the gel solidifies.

5. Pour out the iso-propanol.

Stacking gel preparation:

1. In a 50 ml eppendorf tube add all the components.

Total Volume	1.5 ml	3 ml	5 ml
H2O (ml)	1.05	2.1	3.4
30% acrylamide mix (ml)	0.25	0.5	0.83
1M Tris pH 6.8 (ml)	0.19	0.38	0.63
10% SDS (ml)	0.015	0.03	0.05
10% APS (ml)	0.03	0.06	0.05
TEMED (ml)	0.0015	0.003	0.005

2. Pour the mixture in between the glass plates and add the 10-well comb.

3. Wait for 10-15 mins or until the gel solidifies.

Sample preparation:

1. Take overnight cultures with the desired volume and centrifuge.

2. Take 12 μl of pellet or supernatant (depends on necessity) and move to a new fresh eppendorf.

3. Add 3 μl dye into the eppendorf. Vortex and centrifuge briefly.

4. Heat the eppendorf at 100°C for 10 mins and centrifuge briefly.

5. Put samples in the ice bucket.

Gel running:

1. When the gel solidified, set up the running equipment and pour 1X tank buffer.

2. Take out the comb and load 3 μl of the marker into a well and load the samples into the remaining wells.

3. Run the first 30 mins at 120V then continue to run for 1 hour at 150 V. Note: voltage and time may vary.

Staining:

1. Take out the glass plates out of the buffer tank and split up the glass plates to take out the gel.

2. The stacking gel and put the resolving gel inside an empty box, then add the CBB staining solution until it covers the gel.

3. Put the box on a shaker and shake for 30 mins or until the gel turns blue.

Destaining:

1. Pour the CBB staining solution back into the bottle and add the destaining buffer into the box until it covers the gel.

2. Put the box on a shaker and shake until the protein bands are visible or until the gel turns white.

3. Pour out the destaining buffer.

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-         <title>Experiment</title>
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          <!-- Description-->
-         <section class="resume-section">
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+            <img src="https://static.igem.org/mediawiki/2020/1/15/T--NCKU_Tainan--experiment-cover.jpeg" class="coverphoto">
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-                         Experiment
+                         Experiments
                          <!--<span class="text-primary">Taylor</span>-->
                      </h1>
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-        <hr class="hrmar" />
    <main class="overall">
      <div class="color-block" style="margin-top:3%">
@@ Line 481: / Line 497: @@
            <!--中間protocols的部分-->
            <div class="accordion" id="accordionExample">
--
+         <!--start of every card11111111-->
+          <div class="card">
+            <div class="card-header" id="heading1">
+              <h2 class="mb-0" data-toggle="collapse" data-target="#collapse1">
+                <div class="btn title-fontStyle" aria-expanded="true" aria-controls="collapse1">
+                  Congo red Assay
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+                <span class="plusClass"></span>
+                <span class="minusClass"></span>
+              </h2>
+            </div>
+            <div id="collapse1" class="collapse" aria-labelledby="heading1">
+              <div class="card-body">
+                <div class="container margin-top-small">
+                  <div class="row">
+                    <div class="col">
+                      <div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Materials:</div>
+                      <p><h4>Equipment:</h4></p>
+                      <p>1. Pipette and pipette tips</p>
+                      <p>2. Centrifuge</p>
+                    <p>3. ELISA reader</p>
+                    <p>4. Incubator</p>
+                    <p>5. 96 well plate</p>
+                    <p>6. Centrifuge tube</p>
+                      <span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Consumables:</h4></span>
+                      <p>1. Congo red</p>
+                      <p>2. IPTG</p>
+                    <p>3. LB</p>
+                    <p>4. ddH<sub>2</sub>O</p>
+                    </div>
+                    <div class="col">
+                      <div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Protocol:</div>
+                      <p>1. Culture bacteria NOS-DA-BL21, BW25113 csgD, BW25113 control for 2hr.</p>
+                      <p>2. Add IPTG for induce for 12hr.</p>
+                      <p>3. Adjust OD to 1.</p>
+                      <p>4. Add congo red 3μl to 1ml bacteria.</p>
+                      <p>5. Wait 2hr.</p>
+                      <p>6. Centrifuge full speed 2min.</p>
+                      <p>7. Remove supernatant.</p>
+                      <p>8. Add 1 ml water.</p>
+                      <p>9. Put 200μl into 96 well plate.</p>
+                      <p>10. Air dry.</p>
+                      <p>11. Add water 200μl.</p>
+                      <p>12. Wait 20 min.</p>
+                      <p>13. Remove water.</p>
+                      <p>14. Add water 200μl.</p>
+                      <p>15. Test OD <sub>500</sub></p>
+                    </div>
+                  </div>
+                </div>
+              </div>
+            </div>
+          </div>
+         <!--start of every card222222-->
+          <div class="card">
+            <div class="card-header" id="heading2">
+              <h2 class="mb-0" data-toggle="collapse" data-target="#collapse2">
+                <div class="btn title-fontStyle" aria-expanded="true" aria-controls="collapse2">
+                  Biofilm Assay
+                </div>
+                <span class="plusClass"></span>
+                <span class="minusClass"></span>
+              </h2>
+            </div>
+            <div id="collapse2" class="collapse" aria-labelledby="heading2">
+              <div class="card-body">
+                <div class="container margin-top-small">
+                  <div class="row">
+                    <div class="col">
+                      <div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Materials:</div>
+                      <p><h4>Equipment:</h4></p>
+                       <p>1. Pipette and pipette tips</p>
+                      <p>2. Centrifuge</p>
+                    <p>3. ELISA reader</p>
+                    <p>4. Incubator</p>
+                    <p>5. 96 well plate</p>
+                    <p>6. Centrifuge tube</p>
+                      <span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Consumables:</h4></span>
+                      <p>1. IPTG</p>
+                    <p>2. LB</p>
+                    <p>3. ddH<sub>2</sub>O</p>
+                    </div>
+                    <div class="col">
+                      <div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Protocol:</div>
+                      <p>1. Culture bacteria NOS-DA-BL21, BW25113 csgD, BW25113 control for 2hr.</p>
+                      <p>2. Add IPTG for induce for 12hr.</p>
+                      <p>3. Adjust OD to 1.</p>
+                      <p>4. Add congo red 3μl to 1ml bacteria.</p>
+                      <p>5. Wait 2hr.</p>
+                      <p>6. Centrifuge full speed 2min.</p>
+                      <p>7. Remove supernatant.</p>
+                    </div>
+                  </div>
+                </div>
+              </div>
+            </div>
+          </div>
+         <!--start of every card333333-->
              <div class="card">
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+               <div class="card-header" id="heading3">
-                 <h2 class="mb-0" id="firstOne" data-toggle="collapse" data-target="#collapseOne" style="border-top: 2px solid brown !important;border-bottom: 2px solid brown !important;">
+                 <h2 class="mb-0" id="firstOne" data-toggle="collapse" data-target="#collapse3" style="border-top: 2px solid brown !important;border-bottom: 2px solid brown !important;">
-                   <div class="btn title-fontStyle" aria-expanded="false" aria-controls="collapseOne">
+                   <div class="btn title-fontStyle" aria-expanded="false" aria-controls="collapse3">
-                     NOS Kinetic test
+                     NOS Kinetic Test
                    </div>
                    <span class="plusClass"></span>
@@ Line 492: / Line 607: @@
                  </h2>
                </div>
-               <div id="collapseOne" class="collapse" aria-labelledby="headingOne">
+               <div id="collapse3" class="collapse" aria-labelledby="heading3">
                  <div class="card-body">
                    <div class="container margin-top-small">
@@ Line 499: / Line 614: @@
                          <div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Materials:</div>
                           <p><h4>Equipment:</h4></p>
-                         <p>1. Pipette and pipette tips</p>
+                        <p>1. Pipette and pipette tips</p>
+                      <p>2. Centrifuge</p>
+                    <p>3. ELISA reader</p>
+                    <p>4. Incubator</p>
+                    <p>5. 96 well plate</p>
+                    <p>6. Centrifuge tube</p>
                           <p><span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Consumables:</h4></span></p>
                           <p>1. NOS kit</p>
+                       <p>2. IPTG</p>
+                    <p>3. LB</p>
+                    <p>4. ddH<sub>2</sub>O</p>
                        </div>
                        <div class="col" style="padding-left:0;">
@@ Line 510: / Line 633: @@
                          <p>3. Add IPTG 0.1 one hr.</p>
                          <p>4. Sonication.</p>
-                         <p>5. Put 60ul of cell (NOSDA BL21) into 96well. </p>
+                         <p>5. Put 60μl of cell (NOSDA BL21) into 96well. </p>
                          <p><span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>NOS assay:</h4></span></p>
-                         <p style="margin-bottom:1rem;">1. Prepare 40ul reaction mix for each well.</p>
+                         <p style="margin-bottom:1rem;">1. Prepare 40μl reaction mix for each well.</p>
                          <table class="table table-Border">
                            <thead>
@@ Line 543: / Line 666: @@
                            </tbody>
                          </table>
-                         <p>2. Add 40ul reaction mix for each well by 0, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 min.</p>
+                         <p>2. Add 40μl reaction mix for each well by 0, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 min.</p>
                          <p>3. Incubate 10 mins 37<sup>o</sup>C.</p>
-                         <p>4. Add 95ul NOS assay buffer to each well.</p>
+                         <p>4. Add 95μl NOS assay buffer to each well.</p>
-                         <p>5. Add 5ul enhancer to each well.</p>
+                         <p>5. Add 5μl enhancer to each well.</p>
                          <p>6. Incubate room temperature 10mins.</p>
-                         <p>7. Add 50uL reagent 1 and 50uL reagent 2 to each well.</p>
+                         <p>7. Add 50μL reagent 1 and 50μL reagent 2 to each well.</p>
                          <p>8. Incubate for 10 mins.</p>
-                         <p>9. Measure OD540.</p>
+                         <p>9. Measure OD<sub>540</sub>.</p>
                        </div>
                      </div>
@@ Line 558: / Line 681: @@
              </div>
            </div>
-          <!--start of every card3333333-->
+         <!--start of every card444444-->
            <div class="card">
-             <div class="card-header" id="headingTwo">
+             <div class="card-header" id="heading4">
-               <h2  class="mb-0" data-toggle="collapse" data-target="#collapseTwo">
+               <h2  class="mb-0" data-toggle="collapse" data-target="#collapse4">
-                 <div class="btn title-fontStyle" aria-expanded="false" aria-controls="collapseTwo">
+                 <div class="btn title-fontStyle" aria-expanded="false" aria-controls="collapse4">
-                   IPTG induce NOS test
+                   IPTG Induce NOS Test
                  </div>
                  <span class="plusClass"></span>
@@ Line 569: / Line 692: @@
                </h2>
              </div>
-             <div id="collapseTwo" class="collapse" aria-labelledby="headingTwo">
+             <div id="collapse4" class="collapse" aria-labelledby="heading4">
                <div class="card-body">
                  <div class="container margin-top-small">
@@ Line 577: / Line 700: @@
                           <p><h4>Equipment:</h4></p>
                           <p>1. Pipette and pipette tips</p>
+                    <p>2. Pipette and pipette tips</p>
+                      <p>3. Centrifuge</p>
+                    <p>4. ELISA reader</p>
+                    <p>5. Incubator</p>
+                    <p>6. 96 well plate</p>
+                    <p>7. Centrifuge tube</p>
                           <p><span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Consumables:</h4></span></p>
                           <p>1. NOS kit</p>
+                       <p>2. IPTG</p>
+                    <p>3. LB</p>
+                    <p>4. ddH<sub>2</sub>O</p>
                      </div>
                      <div class="col" style="padding-left:0;">
@@ Line 588: / Line 720: @@
                          <p>4. Sonication.</p>
                          <p><span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>NOS assay kit:</h4></span></p>
-                         <p>1. Put 60ul of cell (NOSDA BL21) into 96well.</p>
+                         <p>1. Put 60μl of cell (NOSDA BL21) into 96well.</p>
-                         <p style="margin-bottom:1rem;">2. Prepare 40ul reaction mix for each well.</p>
+                         <p style="margin-bottom:1rem;">2. Prepare 40μl reaction mix for each well.</p>
                          <table class="table table-Border">
                            <thead>
@@ Line 620: / Line 752: @@
                            </tbody>
                          </table>
-                         <p>3. Add 40ul reaction mix for each well by 0, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 min.</p>
+                         <p>3. Add 40μl reaction mix for each well by 0, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 min.</p>
                          <p>4. Incubate 10 mins 37<sup>o</sup>C.</p>
-                         <p>5. Add 95ul NOS assay buffer to each well.</p>
+                         <p>5. Add 95μl NOS assay buffer to each well.</p>
-                         <p>6. Add 5ul enhancer to each well.</p>
+                         <p>6. Add 5μl enhancer to each well.</p>
                          <p>7. Incubate room temperature 10mins.</p>
-                         <p>8. Add 50uL reagent 1 and 50uL reagent 2 to each well.</p>
+                         <p>8. Add 50μL reagent 1 and 50μL reagent 2 to each well.</p>
                          <p>9. Incubate for 10 mins.</p>
-                         <p>10. Measure OD540.</p>
+                         <p>10. Measure OD<sub>540</sub>.</p>
                      </div>
                    </div>
@@ Line 634: / Line 766: @@
              </div>
            </div>
-          <!--start of every card4444444-->
+         <!--start of every card5555555-->
            <div class="card">
-             <div class="card-header" id="headingThree">
+             <div class="card-header" id="heading5">
-               <h2 class="mb-0"data-toggle="collapse" data-target="#collapseThree">
+               <h2 class="mb-0" data-toggle="collapse" data-target="#collapse5">
-                 <div class="btn title-fontStyle" aria-expanded="false" aria-controls="collapseThree">
+                 <div class="btn title-fontStyle" aria-expanded="true" aria-controls="collapse5">
-                   Ligation
+                   LB Preparation
                  </div>
                  <span class="plusClass"></span>
@@ Line 645: / Line 777: @@
                </h2>
              </div>
-             <div id="collapseThree" class="collapse" aria-labelledby="headingThree">
+             <div id="collapse5" class="collapse" aria-labelledby="heading5">
                <div class="card-body">
                  <div class="container margin-top-small">
@@ Line 651: / Line 783: @@
                      <div class="col">
                        <div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Materials:</div>
-                       <h4>Equipment:</h4>
+                       <p><h4>Equipment:</h4></p>
-                       <p>1. Eppendorf tubes</p>
+                       <p>1. Glass bottle (for LB broth) or Erlenmeyer flask (for agar medium)</p>
-                       <p>2. Pipette and pipette tips</p>
+                       <p>2. Magnetic stirrer</p>
-                       <p>3. Centrifuge</p>
+                       <p>3. Magnetic stirring bar</p>
-                       <p><span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Consumables:</h4></span></p>
+                       <p>4. Plastic measure jug</p>
-                       <p>1. T4 DNA ligase (NEB)</p>
+                      <p>5. Measure cylinder</p>
-                       <p>2. T4 DNA ligase buffer (NEB)</p>
+                      <p>6. Spoon</p>
+                      <p>7. Petri dish (for agar medium)</p>
+                      <p>8. Aluminum foil</p>
+                      <p>9. Electronic balance</p>
+                      <p>10. Weighing paper or weighing bowl</p>
+                      <p>11. Pipette and pipette tips</p>
+                      <span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Consumables:</h4></span>
+                      <p>1. DW (distilled water)</p>
+                       <p>2. Tryptone</p>
+                      <p>3. Yeast extract</p>
+                      <p>4. NaCl</p>
+                      <p>5. NaOH (10N)</p>
+                       <p>6. Agar (for LB agar)</p>
+                      <p>7. Antibiotics (for selection plate)</p>
                      </div>
                      <div class="col">
                        <div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Protocol:</div>
-                       <p style="margin-bottom:1rem;">1. Prepare 40ul reaction mix for each well.</p>
+                       <p style="margin-bottom:1rem;">1. Prepare mixture as the following inside a jar with a magnetic stirring bar inside and place it on the magnetic stirrer.</p>
-                        <table class="table table-Border">
+                          <table class="table table-Border">
                            <thead>
                              <tr style="border:3px solid #7E3B40;">
                                <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">Components</th>
-                               <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">Volume (μl)</th>
+                               <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">Amount</th>
                              </tr>
                            </thead>
                            <tbody>
                              <tr>
-                               <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">Vector DNA</th>
+                               <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">DW</th>
-                               <td style="font-size:1.1rem;">12</td>
+                               <td style="font-size:1.1rem;">98 ml</td>
                              </tr>
                              <tr>
-                               <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">Insert DNA</th>
+                               <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">Tryptone</th>
-                               <td style="font-size:1.1rem;">40</td>
+                               <td style="font-size:1.1rem;">1 g</td>
                              </tr>
                              <tr>
-                               <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">Fast Ligase 2X buffer</th>
+                               <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">Yeast Extract</th>
-                               <td colspan="1" style="font-size:1.1rem;">5.8</td>
+                               <td colspan="1" style="font-size:1.1rem;">0.5 g</td>
                              </tr>
                              <tr>
-                               <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">T4 ligase</th>
+                               <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">NaCl</th>
-                               <td style="font-size:1.1rem;">0.5</td>
+                               <td style="font-size:1.1rem;">1 g</td>
                              </tr>
                              <tr>
+                              <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">NaOH (10N)</th>
+                              <td style="font-size:1.1rem;">20 μl</td>
+                            </tr>
+                            <tr>
                                <th scope="row" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">Total Volume</th>
-                               <th colspan="1" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">58.3</td>
+                               <th colspan="1" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">100 ml</td>
                              </tr>
+                            <tr>
+                              <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">Agar (for LB agar)</th>
+                              <td style="font-size:1.1rem;">1.50%</td>
+                            </tr>
                            </tbody>
                          </table>
-                       <p>2. Gently mix the reaction and centrifuge.</p>
+                       <p>2. Mix well, pour the mixture into the bottle or flask and autoclave. Notes: For agar medium, pour the mixture to the petri dish and dry the plates.</p>
-                       <p>3. Incubate at 16°C overnight.</p>
+                       <p>For selection plates, add antibiotics as the following before pouring the mixture to the petri dish:</p>
-                       <p>4. Keep the DNA solution in -20°C freezer.</p>
+                       <p><li style="font-size: 1rem;">Kanamycin: 100 μl/100 ml media</p></li>
+                      <p><li style="font-size: 1rem;">Chloramphenicol: 50 μl/100 ml media</p></li>
+                      <p><li style="font-size: 1rem;">Ampicillin: 100 μl/100 μl media</p></li>
                      </div>
                    </div>
@@ Line 701: / Line 856: @@
              </div>
            </div>
-          <!--start of every card5555555-->
+         <!--start of every card666666-->
+            <div class="card">
+              <div class="card-header" id="heading6">
+                <h2 class="mb-0" id="firstOne" data-toggle="collapse" data-target="#collapse6" style="border-top: 2px solid brown !important;border-bottom: 2px solid brown !important;">
+                  <div class="btn title-fontStyle" aria-expanded="false" aria-controls="collapse6">
+                    Competent Cell Preparation
+                  </div>
+                  <span class="plusClass"></span>
+                  <span class="minusClass"></span>
+                </h2>
+              </div>
+              <div id="collapse6" class="collapse" aria-labelledby="heading6">
+                <div class="card-body">
+                  <div class="container margin-top-small">
+                    <div class="row">
+                      <div class="col">
+                        <div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Protocol:</div>
+                        <p><span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Equipment:</h4></span></p>
+                          <p>1. Glass bottle (for LB broth) or Erlenmeyer flask (for agar medium)</p>
+                      <p>2. Magnetic stirrer</p>
+                      <p>3. Magnetic stirring bar</p>
+                      <p>4. Plastic measure jug</p>
+                      <p>5. Measure cylinder</p>
+                      <p>6. Spoon</p>
+                      <p>7. Petri dish (for agar medium)</p>
+                      <p>8. Aluminum foil</p>
+                      <p>9. Electronic balance</p>
+                      <p>10. Weighing paper or weighing bowl</p>
+                      <p>11. Pipette and pipette tips</p>
+                      <span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Consumables:</h4></span>
+                     <p>1. CaCl<sub>2</sub></p>
+                      <p>2. Glycerol</p>
+                    <p>3. LB</p>
+                    <p>4. ddH<sub>2</sub>O</p>
+                      </div>
+                      <div class="col" style="padding-left:0;">
+                        <div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;visibility:hidden">Protocol:</div>
+                       <p><h4>Culture bacteria for making competent cell:</h4></p>
+                         <p>1. Add 6mL LB into the test tube.</p>
+                         <p>2. Pick one colony from the plate and add it into the test tube.</p>
+                         <p>3. Culture O.N. 37C, 200 rpm.</p>
+                        <p><h4>Test O.D. value & make competent cell:</h4></p>
+                        <p>1. Add 1mL overnight bacterial culture to 50mL LB.</p>
+                        <p>2. When the O.D. is about 0.3~0.4, centrifuge 5000 rpm, 10 mins, discard the supernatant.</p>
+                        <p>3. Resuspend the bacteria pellet in 25 ml ice cold 100 mM CaCl<sub>2</sub> solution for 30 minutes on ice. Centrifuge the cell suspension at 5000 rpm in the Sorvall GSA rotor for 10 minutes. Discard the supernatant.</p>
+                        <p>4. Resuspend the bacteria pellet on ice in 1ml of ice cold 100 mM CaCl<sub>2</sub>/15% glycerol (sterile) in each.</p>
+                        <p>5. Dispense the bacteria in 100 mL aliquots (on ice) to 10 eppendorf.</p>
+                        <p>6. Freeze cells at -80<sup>o</sup>C.</p>
+                      </div>
+                    </div>
+                  </div>
+                </div>
+              </div>
+            </div>
+         <!--start of every card7777777-->
            <div class="card">
-             <div class="card-header" id="headingFour">
+             <div class="card-header" id="heading7">
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+                 <div class="btn title-fontStyle" aria-expanded="true" aria-controls="collapse7">
                    Standard PCR
                  </div>
@@ Line 712: / Line 925: @@
                </h2>
              </div>
-             <div id="collapseFour" class="collapse" aria-labelledby="headingFour">
+             <div id="collapse7" class="collapse" aria-labelledby="heading7">
                <div class="card-body">
                  <div class="container margin-top-small">
@@ Line 732: / Line 945: @@
                      <div class="col">
                        <div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Protocol:</div>
-                       <p style="margin-bottom:1rem;">1. Prepare 40ul reaction mix for each well.</p>
+                       <p style="margin-bottom:1rem;">1. Prepare 40μl reaction mix for each well.</p>
                        <table class="table table-Border">
                            <thead>
@@ Line 822: / Line 1,035: @@
              </div>
            </div>
-          <!--start of every card6666666-->
+         <!--start of every card888888-->
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-            <div class="card-header" id="headingFive">
-              <h2 class="mb-0" data-toggle="collapse" data-target="#collapseFive">
-                <div class="btn title-fontStyle" aria-expanded="true" aria-controls="collapseFive">
-                  SDS-PAGE
-                </div>
-                <span class="plusClass"></span>
-                <span class="minusClass"></span>
-              </h2>
-            </div>
-            <div id="collapseFive" class="collapse" aria-labelledby="headingFive">
-              <div class="card-body">
-                <div class="container margin-top-small">
-                  <div class="row">
-                    <div class="col">
-                      <div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Materials:</div>
-                      <p><h4>Equipment:</h4></p>
-                      <p>1. Eppendorf tubes</p>
-                      <p>2. Pipette and pipette tips</p>
-                      <p>3. Centrifuge</p>
-                      <p>4. Vortex</p>
-                      <p>5. Ice bucket</p>
-                      <p>6. Empty box</p>
-                      <p>7. Dry Thermounit</p>
-                      <p>8. Glass plates</p>
-                      <p>9. 10-well comb</p>
-                      <p>10. Spacer</p>
-                      <p>11. Clamp</p>
-                      <p>12. Casting stand</p>
-                      <p>13. Buffer tank</p>
-                      <p>14. Voltage source</p>
-                      <p>15. Shaker</p>
-                      <p><h4>Consumables:</h4></p>
-                      <p>1. H<sub>2</sub>O</p>
-                      <p>2. 30% acrylamide</p>
-                      <p>3. 1.5M tris pH 8.8</p>
-                      <p>4. 1M tris pH 6.8</p>
-                      <p>5. 10% SDS</p>
-                      <p>6. 10% APS</p>
-                      <p>7. TEMED</p>
-                      <p>8. Prestained Protein Marker - Bioman</p>
-                      <p>9. Protein dye</p>
-                      <p>10. Overnight culture (sample)</p>
-                      <p>11. Coomassie Brilliant Blue (CBB) staining solution</p>
-                      <p>12. Destaining buffer</p>
-                      <p>13. Tank buffer (1X)</p>
-                      <p>14. Isopropanol</p>
-                    </div>
-                    <div class="col">
-                      <div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Protocol:</div>
-                        <p><h4>Resolving gel preparation:</h4></p>
-                        <p>1. Adjust the amount of agarose to get the desired gel concentration.</p>
-                        <p style="margin-bottom:1rem;">2. In a 50 ml eppendorf tube add all the components 15% gel concentration.</p>
-                        <table class="table table-Border">
-                          <thead>
-                            <tr style="border:3px solid #7E3B40;">
-                              <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">Total Volume</th>
-                              <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">5 ml</th>
-                              <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">10 ml</th>
-                              <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">15 ml</th>
-                            </tr>
-                          </thead>
-                          <tbody>
-                            <tr>
-                              <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">H2O (ml)</th>
-                              <td style="font-size:1.1rem;">1.15</td>
-                              <td style="font-size:1.1rem;">2.3</td>
-                              <td style="font-size:1.1rem;">3.4</td>
-                            </tr>
-                            <tr>
-                              <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">30% acrylamide mix (ml)</th>
-                              <td style="font-size:1.1rem;">2.5</td>
-                              <td style="font-size:1.1rem;">5</td>
-                              <td style="font-size:1.1rem;">7.5</td>
-                            </tr>
-                            <tr>
-                              <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">1.5M Tris pH 8.8 (ml)</th>
-                              <td colspan="1" style="font-size:1.1rem;">1.25</td>
-                              <td colspan="1" style="font-size:1.1rem;">2.5</td>
-                              <td colspan="1" style="font-size:1.1rem;">3.3</td>
-                            </tr>
-                            <tr>
-                              <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">10% SDS (ml)</th>
-                              <td style="font-size:1.1rem;">0.05</td>
-                              <td style="font-size:1.1rem;">0.1</td>
-                              <td style="font-size:1.1rem;">0.15</td>
-                            </tr>
-                            <tr>
-                              <th scope="row" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">10% APS (ml)</th>
-                              <th colspan="1" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">0.1</td>
-                              <th colspan="1" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">0.2</td>
-                              <th colspan="1" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">0.3</td>
-                            </tr>
-                            <tr>
-                              <th scope="row" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">TEMED (ml)</th>
-                              <th colspan="1" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">0.002</td>
-                              <th colspan="1" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">0.004</td>
-                              <th colspan="1" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">0.006</td>
-                            </tr>
-                          </tbody>
-                        </table>
-                        <p>3. Pour the mixture in between the glasses and add iso-propanol afterward.</p>
-                        <p>4. Wait for 10-15 mins or until the gel solidifies.</p>
-                        <p>5. Pour out the iso-propanol.</p>
-                        <p><span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Stacking gel preparation:</h4></span></p>
-                        <p style="margin-bottom:1rem;">1. In a 50 ml eppendorf tube add all the components.</p>
-                        <table class="table table-Border">
-                          <thead>
-                            <tr style="border:3px solid #7E3B40;">
-                              <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">Total Volume</th>
-                              <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">1.5 ml</th>
-                              <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">3 ml</th>
-                              <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">5 ml</th>
-                            </tr>
-                          </thead>
-                          <tbody>
-                            <tr>
-                              <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">H2O (ml)</th>
-                              <td style="font-size:1.1rem;">1.15</td>
-                              <td style="font-size:1.1rem;">2.3</td>
-                              <td style="font-size:1.1rem;">3.4</td>
-                            </tr>
-                            <tr>
-                              <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">30% acrylamide mix (ml)</th>
-                              <td style="font-size:1.1rem;">2.5</td>
-                              <td style="font-size:1.1rem;">5</td>
-                              <td style="font-size:1.1rem;">7.5</td>
-                            </tr>
-                            <tr>
-                              <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">1.5M Tris pH 8.8 (ml)</th>
-                              <td colspan="1" style="font-size:1.1rem;">1.25</td>
-                              <td colspan="1" style="font-size:1.1rem;">2.5</td>
-                              <td colspan="1" style="font-size:1.1rem;">3.3</td>
-                            </tr>
-                            <tr>
-                              <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">10% SDS (ml)</th>
-                              <td style="font-size:1.1rem;">0.05</td>
-                              <td style="font-size:1.1rem;">0.1</td>
-                              <td style="font-size:1.1rem;">0.15</td>
-                            </tr>
-                            <tr>
-                              <th scope="row" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">10% APS (ml)</th>
-                              <th colspan="1" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">0.1</td>
-                              <th colspan="1" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">0.2</td>
-                              <th colspan="1" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">0.3</td>
-                            </tr>
-                            <tr>
-                              <th scope="row" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">TEMED (ml)</th>
-                              <th colspan="1" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">0.002</td>
-                              <th colspan="1" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">0.004</td>
-                              <th colspan="1" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">0.006</td>
-                            </tr>
-                          </tbody>
-                        </table>
-                        <p>2. Add 40ul reaction mix for each well by 0, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 min.</p>
-                        <p>3. Incubate 10 mins 37<sup>o</sup>C.</p>
-                        <p>4. Add 95ul NOS assay buffer to each well.</p>
-                        <p>5. Add 5ul enhancer to each well.</p>
-                        <p>6. Incubate room temperature 10mins.</p>
-                        <p>7. Add 50uL reagent 1 and 50uL reagent 2 to each well.</p>
-                        <p>8. Incubate for 10 mins.</p>
-                        <p>9. Measure OD540.</p>
-                    </div>
-                  </div>
-                </div>
-              </div>
-            </div>
-          </div>
-          <!--start of every card7777777-->
-          <div class="card">
-            <div class="card-header" id="headingSix">
-              <h2 class="mb-0" data-toggle="collapse" data-target="#collapseSix">
-                <div class="btn title-fontStyle" aria-expanded="true" aria-controls="collapseSix">
-                  Ligation
-                </div>
-                <span class="plusClass"></span>
-                <span class="minusClass"></span>
-              </h2>
-            </div>
-            <div id="collapseSix" class="collapse" aria-labelledby="headingSix">
-              <div class="card-body">
-                <div class="container margin-top-small">
-                  <div class="row">
-                    <div class="col">
-                      <div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Materials:</div>
-                      <p><h4>Equipment:</h4></p>
-                      <p>1. Eppendorf tubes</p>
-                      <p>2. Pipette and pipette tips</p>
-                      <p>3. Centrifuge</p>
-                      <span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Consumables:</h4></span>
-                      <p>1. T4 DNA ligase (NEB)</p>
-                      <p>2. T4 DNA ligase buffer (NEB)</p>
-                    </div>
-                    <div class="col">
-                      <div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Protocol:</div>
-                      <p>1. Set up the following reaction on ice:</p>
-                      <table class="table table-Border">
-                        <thead>
-                          <tr>
-                            <td scope="col" style="border:1px #7E3B40 solid; font-size: 1.1rem;">Vector</th>
-                            <td scope="col" style="border:1px #7E3B40 solid; text-align: center; font-size: 1.1rem;">12 μl</th>
-                          </tr>
-                        </thead>
-                        <tbody>
-                          <tr>
-                            <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">Insert</th>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">40 μl</td>
-                          </tr>
-                          <tr>
-                            <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">T4 DNA ligase buffer (10x)</th>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">5.8 μl</td>
-                          </tr>
-                          <tr>
-                            <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">T4 DNA ligase</th>
-                            <td colspan="1" style="font-size: 1.1rem;">0.5 μl</td>
-                          </tr>
-                          <tr style="border:3px #7E3B40 solid">
-                            <th scope="row" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">Total Volume</th>
-                            <th style="font-size:1.2rem; text-align: center;">58.3 μl</td>
-                          </tr>
-                        </tbody>
-                      </table>
-                      <p>2. Gently mix the reaction and centrifuge.</p>
-                      <p>3. Incubate at 16°C overnight.</p>
-                      <p>4. Keep the DNA solution in -20°C freezer.</p>
-                    </div>
-                  </div>
-                </div>
-              </div>
-            </div>
-          </div>
-          <!--start of every card9999999-->
            <div class="card">
-             <div class="card-header" id="headingEight">
+             <div class="card-header" id="heading8">
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+               <h2 class="mb-0" data-toggle="collapse" data-target="#collapse8">
-                 <div class="btn title-fontStyle" aria-expanded="true" aria-controls="collapseEight">
+                 <div class="btn title-fontStyle" aria-expanded="true" aria-controls="collapse8">
                    PCR Clean-up
                  </div>
@@ Line 1,066: / Line 1,046: @@
                </h2>
              </div>
-             <div id="collapseEight" class="collapse" aria-labelledby="headingEight">
+             <div id="collapse8" class="collapse" aria-labelledby="heading8">
                <div class="card-body">
                  <div class="container margin-top-small">
@@ Line 1,108: / Line 1,088: @@
              </div>
            </div>
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+             <div class="card-header" id="heading9">
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+               <h2 class="mb-0" data-toggle="collapse" data-target="#collapse9">
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+                 <div class="btn title-fontStyle" aria-expanded="true" aria-controls="collapse9">
-                  Plasmid Isolation: Miniprep
-                </div>
-                <span class="plusClass"></span>
-                <span class="minusClass"></span>
-              </h2>
-            </div>
-            <div id="collapseNine" class="collapse" aria-labelledby="headingNine">
-              <div class="card-body">
-                <div class="container margin-top-small">
-                  <div class="row">
-                    <div class="col">
-                      <div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Materials:</div>
-                      <p><h4>Equipment:</h4></p>
-                      <p>1. Eppendorf tubes</p>
-                      <p>2. Collection tubes</p>
-                      <p>3. Spin column</p>
-                      <p>4. Pipette and pipette tips</p>
-                      <p>5. Centrifuge</p>
-                      <p>6. Ice bucket</p>
-                      <span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Consumables:</h4></span>
-                      <p>1. Suspension buffer</p>
-                      <p>2. Lysis buffer</p>
-                      <p>3. Binding buffer</p>
-                      <p>4. Washing buffer I</p>
-                      <p>5. Washing buffer II</p>
-                      <p>6. Elution buffer</p>
-                      <p>7. LB broth</p>
-                      <p>8. Antibiotic as needed</p>
-                    </div>
-                    <div class="col">
-                      <div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Protocol:</div>
-                      <p>1. Prepare 2-5 ml overnight culture in LB medium with the antibiotic (depends on the plasmid to be extracted).</p>
-                      <p>2. Collect cells from the overnight culture with a centrifuge (12,000 rpm 30 sec) and discard the supernatant.</p>
-                      <p>3. Add 250 μl of suspension buffer and suspend bacterial cells by vortex.</p>
-                      <p>4. Add 250 μl of lysis buffer and mix gently by inverting the tube 10 times. </p>
-                      <p>5. Add 350 μl of binding buffer and mix gently by inverting the tube 10 times. </p>
-                      <p>6. Incubate on ice for 5 mins. </p>
-                      <p>7. Centrifuge at 4°C, 12,000 rpm for 10 mins.</p>
-                      <p>8. Place a spin column in a provided collection tube. Transfer 750 μl of supernatant to spin column.</p>
-                      <p>9. Centrifuge at room temperature, 12,000 rpm for 30 sec and discard the flow-through.</p>
-                      <p>10. Add 500 μl of washing buffer I to the spin column and centrifuge for 30 sec. Discard the flow-through.</p>
-                    </div>
-                  </div>
-                </div>
-              </div>
-            </div>
-          </div>
-          <!--start of every card1111111-->
-          <div class="card">
-            <div class="card-header" id="headingTen">
-              <h2 class="mb-0" data-toggle="collapse" data-target="#collapseTen">
-                <div class="btn title-fontStyle" aria-expanded="true" aria-controls="collapseTen">
                    Restriction Enzyme Digestion
                  </div>
@@ Line 1,171: / Line 1,099: @@
                </h2>
              </div>
-             <div id="collapseTen" class="collapse" aria-labelledby="headingTen">
+             <div id="collapse9" class="collapse" aria-labelledby="heading9">
                <div class="card-body">
                  <table class="table table-Border" style="margin: 5px auto;width:50%;">
@@ Line 1,224: / Line 1,152: @@
                            <tr style="border: 1px #7E3B40 solid;">
                              <td scope="col" style="font-size: 1.1rem;">DNA</td>
-                             <td scope="col" style="font-size: 1.1rem;">43 μl</td>
+                             <td scope="col" style="font-size: 1.1rem;">15 μl</td>
                            </tr>
                          </thead>
@@ Line 1,230: / Line 1,158: @@
                            <tr>
                              <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">Buffer 10x</td>
-                             <td style="font-size: 1.1rem;">5 μl</td>
+                             <td style="font-size: 1.1rem;">3 μl</td>
                            </tr>
                            <tr>
@@ Line 1,242: / Line 1,170: @@
                            <tr style="font-size:1.2rem; text-align: center; border: 3PX #7E3B40 solid;">
                              <th scope="row" style="font-size: 1.2rem;">Total Volume</th>
-                             <th style="font-size: 1.2rem; text-align: center;">50 μl</td>
+                             <th style="font-size: 1.2rem; text-align: center;">20 μl</td>
                            </tr>
                          </tbody>
@@ Line 1,280: / Line 1,208: @@
              </div>
            </div>
-          <!--start of every card12121212-->
+         <!--start of every card10101010-->
            <div class="card">
-             <div class="card-header" id="heading12">
+             <div class="card-header" id="heading10">
-               <h2 class="mb-0" data-toggle="collapse" data-target="#collapse12">
+               <h2 class="mb-0" data-toggle="collapse" data-target="#collapse10">
-                 <div class="btn title-fontStyle" aria-expanded="true" aria-controls="collapse12">
+                 <div class="btn title-fontStyle" aria-expanded="true" aria-controls="collapse10">
-                   SDS-PAGE
+                   Gel Extraction and Purification
                  </div>
                  <span class="plusClass"></span>
@@ Line 1,291: / Line 1,219: @@
                </h2>
              </div>
-             <div id="collapse12" class="collapse" aria-labelledby="heading12">
+             <div id="collapse10" class="collapse" aria-labelledby="heading10">
                <div class="card-body">
                  <div class="container margin-top-small">
@@ Line 1,299: / Line 1,227: @@
                        <p><h4>Equipment:</h4></p>
                        <p>1. Eppendorf tubes</p>
-                       <p>2. Pipette and pipette tips</p>
+                       <p>2. Collection tubes</p>
-                       <p>3. Centrifuge</p>
+                       <p>3. Spin column</p>
-                       <p>4. Vortex</p>
+                       <p>4. Pipette and pipette tips</p>
-                       <p>5. Ice bucket</p>
+                       <p>5. Centrifuge</p>
-                       <p>6. Empty box</p>
+                       <p>6. Scalpel</p>
                        <p>7. Dry Thermounit</p>
-                       <p>8. Glass plates</p>
+                       <p><h4>Consumables:</h4></p>
-                      <p>9. 10-well comb</p>
+                       <p>1. Isopropanol</p>
-                      <p>10. Spacer</p>
+                       <p>2. Binding buffer</p>
-                      <p>11. Clamp</p>
+                       <p>3. Washing buffer</p>
-                      <p>12. Casting stand</p>
+                       <p>4. Elution buffer</p>
-                      <p>13. Buffer tank</p>
-                      <p>14. Voltage source</p>
-                      <p>15. Shaker</p>
-                      <span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Consumables:</h4></span>
-                       <p>1. H<sub>2</sub>O</p>
-                       <p>2. 30% acrylamide</p>
-                       <p>3. 1.5M tris pH 8.8</p>
-                       <p>4. 1M tris pH 6.8</p>
-                      <p>5. 10% SDS</p>
-                      <p>6. 10% APS</p>
-                      <p>7. TEMED</p>
-                      <p>8. Prestained Protein Marker - Bioman</p>
-                      <p>9. Protein dye</p>
-                      <p>10. Overnight culture (sample)</p>
-                      <p>11. CBB (Coomassie Brilliant Blue) staining solution</p>
-                      <p>12. Destaining buffer</p>
-                      <p>13. Tank buffer (1X)</p>
-                      <p>14. Iso-propanol</p>
                      </div>
                      <div class="col">
                        <div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Protocol:</div>
-                       <p><h5>Resolving gel preparation</h5></p>
+                       <p><h5>Gel excision, solubilization and DNA binding:</h5></p>
-                       <p>1. Adjust the amount of agarose to get the desired gel concentration</p>
+                       <p>1. Excise band with scalpel and transfer to a new eppendorf tube.</p>
-                      <p>2. In a 50 ml eppendorf tube add all the components 15% gel concentration</p>
+                       <p>2. Weigh the gel slice in a tube (by measuring the weight difference of an empty eppendorf and the eppendorf with gel slice in the tube).</p>
-                       <table class="table table-Border">
+                       <p>3. Add 3 volumes of binding buffer to 1 volume of gel (100 mg = 100 μl).</p>
-                        <thead>
+                       <p>4. Incubate at 60°C for 2-10 mins (or until the gel has completely dissolved).</p>
-                          <tr>
+                       <p>5. Add 1.5 volume of isopropanol and invert the eppendorf 10 times.</p>
-                            <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">Total Volume</th>
+                       <p>6. Place a spin column in a provided collection tube. Transfer 700 μl sample to the spin column and centrifuge for 30 secs, 12,000 rpm.</p>
-                            <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">5 ml</th>
+                       <p>7. Discard flow-through and place the spin column back into the collection tube.</p>
-                            <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">10 ml</th>
+                       <p><h5>2. Wash:</h5></p>
-                            <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">15 ml</th>
+                       <p>1. Add 500 μl of washing buffer to the spin column and centrifuge for 30 secs, 12,000 rpm.</p>
-                          </tr>
+                       <p>2. Discard flow-through and place the spin column back into the collection tube.</p>
-                        </thead>
+                       <p>3. Add 200 μl of washing buffer to the spin column and centrifuge for 5 mins, 12,000 rpm.</p>
-                        <tbody>
+                       <p>4. Discard flow-through and place the spin column back into the collection tube.</p>
-                          <tr>
+                       <p><h5>3. DNA elution:</h5></p>
-                            <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">H<sub>2</sub>O (ml)</th>
+                       <p>1. Transfer spin column to clean eppendorf. Add 50 μl of elution buffer to the spin column. Centrifuge for 2 mins, 12,000 rpm.</p>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">1.15</td>
+                       <p>2. Collect the pure sample in the eppendorf and discard the spin column.</p>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">2.3</td>
+                       <p>Keep the DNA solution in -20°C freezer.</p>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">3.4</td>
-                          </tr>
-                          <tr>
-                            <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">30% acrylamide mix (ml)</th>
-                            <td colspan="1" style="font-size: 1.1rem;">2.5</td>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">5</td>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">7.5</td>
-                          </tr>
-                          <tr>
-                            <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">1.5M Tris pH 8.8 (ml)</th>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">1.25</td>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">2.5</td>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">3.3</td>
-                          </tr>
-                          <tr>
-                            <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">10% SDS (ml)</th>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">0.05</td>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">0.1</td>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">0.15</td>
-                          </tr>
-                          <tr>
-                            <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">10% APS (ml)</th>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">0.10</td>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">0.2</td>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">0.3</td>
-                          </tr>
-                          <tr>
-                            <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">TEMED (ml)</th>
-                            <td colspan="1" style="font-size: 1.1rem;">0.002</td>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">0.004</td>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">0.006</td>
-                          </tr>
-                        </tbody>
-                      </table>
-                      <p>3. Pour the mixture in between the glasses and add iso-propanol afterward.</p>
-                      <p>4. Wait for 10-15 mins or until the gel solidifies.</p>
-                      <p>5. Pour out the iso-propanol.</p>
-                       <p><h5>Stacking gel preparation</h5></p>
-                      <p>1. In a 50 ml eppendorf tube add all the components</p>
-                      <table class="table table-Border">
-                        <thead>
-                          <tr>
-                            <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">Total Volume</th>
-                            <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">1.5 ml</th>
-                            <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">3 ml</th>
-                            <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">5 ml</th>
-                          </tr>
-                        </thead>
-                        <tbody>
-                          <tr>
-                            <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">H<sub>2</sub>O (ml)</th>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">1.05</td>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">2.1</td>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">3.4</td>
-                          </tr>
-                          <tr>
-                            <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">30% acrylamide mix (ml)</th>
-                            <td colspan="1" style="font-size: 1.1rem;">0.25</td>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">0.5</td>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">0.83</td>
-                          </tr>
-                          <tr>
-                            <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">1M Tris pH 6.8 (ml)</th>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">0.19</td>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">0.38</td>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">0.63</td>
-                          </tr>
-                          <tr>
-                            <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">10% SDS (ml)</th>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">0.015</td>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">0.03</td>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">0.05</td>
-                          </tr>
-                          <tr>
-                            <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">10% APS (ml)</th>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">0.03</td>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">0.06</td>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">0.05</td>
-                          </tr>
-                          <tr>
-                            <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">TEMED (ml)</th>
-                            <td colspan="1" style="font-size: 1.1rem;">0.0015</td>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">0.003</td>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">0.005</td>
-                          </tr>
-                        </tbody>
-                      </table>
-                      <p>2. Pour the mixture in between the glass plates and add the 10-well comb.</p>
-                       <p>3. Wait for 10-15 mins or until the gel solidifies.</p>
-                       <p><h5>Sample preparation</h5></p>
-                      <p>1. Take overnight cultures with the desired volume and centrifuge.</p>
-                       <p>2. Take 12 μl of pellet or supernatant (depends on necessity) and move to a new fresh eppendorf.</p>
-                      <p>3. Add 3 μl dye into the eppendorf. Vortex and centrifuge briefly.</p>
-                       <p>4. Heat the eppendorf at 100°C for 10 mins and centrifuge briefly.</p>
-                      <p>5. Put samples in the ice bucket.</p>
-                       <p><h5>Gel running</h5></p>
-                       <p>1. When the gel solidified, set up the running equipment and pour 1X tank buffer.</p>
-                       <p>2. Take out the comb and load 3 μl of the marker into a well and load the samples into the remaining wells.</p>
-                       <p>3. Run the first 30 mins at 120V then continue to run for 1 hour at 150 V. Note: voltage and time may vary.</p>
-                      <p><h5>Staining</h5></p>
-                      <p>1. Take out the glass plates out of the buffer tank and split up the glass plates to take out the gel.</p>
-                       <p>2. the stacking gel and put the resolving gel inside an empty box, then add the CBB staining solution until it covers the gel.</p>
-                      <p>Put the box on a shaker and shake for 30 mins or until the gel turns blue. </p>
-                       <p><h5>Destaining</h5></p>
-                       <p>1. Pour the CBB staining solution back to the bottle and add the destaining buffer into the box until it covers the gel.</p>
-                       <p>2. Put the box on a shaker and shake until the protein bands are visible or until the gel turns white.</p>
-                       <p>3. Pour out the destaining buffer.</p>
                      </div>
                    </div>
@@ Line 1,461: / Line 1,264: @@
              </div>
            </div>
-          <!--start of every card13131313-->
+         <!--start of every card11111111-->
            <div class="card">
-             <div class="card-header" id="heading13">
+             <div class="card-header" id="heading11">
-               <h2 class="mb-0" data-toggle="collapse" data-target="#collapse13">
+               <h2 class="mb-0"data-toggle="collapse" data-target="#collapse11">
-                 <div class="btn title-fontStyle" aria-expanded="true" aria-controls="collapse13">
+                 <div class="btn title-fontStyle" aria-expanded="false" aria-controls="collapse11">
-                   Standard PCR
+                   Ligation
                  </div>
                  <span class="plusClass"></span>
@@ Line 1,472: / Line 1,275: @@
                </h2>
              </div>
-             <div id="collapse13" class="collapse" aria-labelledby="heading13">
+             <div id="collapse11" class="collapse" aria-labelledby="heading11">
                <div class="card-body">
                  <div class="container margin-top-small">
@@ Line 1,478: / Line 1,281: @@
                      <div class="col">
                        <div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Materials:</div>
-                       <p><h4>Equipment:</h4></p>
+                       <h4>Equipment:</h4>
-                       <p>1. PCR tubes</p>
+                       <p>1. Eppendorf tubes</p>
-                       <p>2. Ice bucket</p>
+                       <p>2. Pipette and pipette tips</p>
-                       <p>3. Thermocycler</p>
+                       <p>3. Centrifuge</p>
-                       <p>4. Pipette and pipette tips</p>
+                       <p><span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Consumables:</h4></span></p>
-                      <span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Consumables:</h4></span>
+                       <p>1. T4 DNA ligase (NEB)</p>
-                      <p>1. MQ or ddH<sub>2</sub>O</p>
+                       <p>2. T4 DNA ligase buffer (NEB)</p>
-                       <p>2. 2x PCR buffer for KOD FX</p>
-                       <p>3. dNTPs 2 mM</p>
-                      <p>4. Forward and reverse primer (10 μM)</p>
-                      <p>5. KOD FX polymerase</p>
                      </div>
                      <div class="col">
                        <div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Protocol:</div>
-                       <p>1. On the ice, add all components in a PCR tube, making up to 50 µl volume reaction.</p>
+                       <p style="margin-bottom:1rem;">1. Prepare 40μl reaction mix for each well.</p>
-                      <table class="table table-Border">
+                         <table class="table table-Border">
-                        <thead>
-                          <tr style="border:3px solid #7E3B40;">
-                            <th scope="col" style="font-size:1.25rem; text-align: center;">Components</th>
-                            <th scope="col" style="font-size:1.25rem; text-align: center;">Volume (μl)</th>
-                          </tr>
-                        </thead>
-                        <tbody>
-                          <tr>
-                            <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">MQ or ddH<sub>2</sub>O</th>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">1.1</td>
-                          </tr>
-                          <tr>
-                            <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">10x PCR buffer</th>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">1</td>
-                          </tr>
-                          <tr>
-                            <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">dNTP 2.5 mM</th>
-                            <td colspan="1" style="font-size: 1.1rem;">0.8</td>
-                          </tr>
-                          <tr>
-                            <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">Template</th>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">1</td>
-                          </tr>
-                          <tr>
-                            <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">Forward primer 10 μM</th>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">1</td>
-                          </tr>
-                          <tr>
-                            <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">Reverse primer 10 μM</th>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">0.1</td>
-                          </tr>
-                          <tr>
-                            <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">Taq polymerase + vent</th>
-                            <td colspan="1" style="font-size: 1.1rem;">0.1</td>
-                          </tr>
-                          <tr style="border:3px solid #7E3B40;">
-                            <th style="text-align: center;vertical-align: middle; font-size: 1.2rem;" scope="row">Total Volume</th>
-                            <th colspan="1" style="font-size: 1.2rem; text-align: center;">10</td>
-                          </tr>
-                        </tbody>
-                      </table>
-                      <p>2. Gently mix the PCR reactions and centrifuge briefly.</p>
-                      <p>3. Transfer the PCR tubes to a thermocycler.</p>
-                      <table class="table table-Border">
-                        <thead>
-                          <tr style="border:3px solid #7E3B40;">
-                            <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">Step</th>
-                            <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">Temp</th>
-                            <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">Time</th>
-                          </tr>
-                        </thead>
-                        <tbody>
-                          <tr>
-                            <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">Initial denaturalization</th>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">94°C</td>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">2 mins</td>
-                          </tr>
-                          <tr>
-                            <td style="text-align: center;vertical-align: middle; font-size: 1.1rem;" scope="row" rowspan="3">25 - 35 cycles</th>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">98°C (denaturation)</td>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">30 secs</td>
-                          </tr>
-                          <tr>
-                            <td colspan="1" style="font-size: 1.1rem;">55°C (annealing)</td>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">30 secs</td>
-                          </tr>
-                          <tr>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">68°C (Extension)</td>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">2 mins</td>
-                          </tr>
-                          <tr>
-                            <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">Final Extension</th>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">68°C</td>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">2 mins</td>
-                          </tr>
-                          <tr>
-                            <td style="text-align: center;vertical-align: middle; font-size: 1.1rem;" scope="row">Hold</th>
-                            <td style="font-size: 1.1rem;">16°C (holding for a short time) or 4°C (holding for a long time)</td>
-                            <td style="text-align: center;vertical-align: middle; font-size: 1.1rem;">∞</td>
-                          </tr>
-                        </tbody>
-                      </table>
-                    </div>
-                  </div>
-                </div>
-              </div>
-            </div>
-          </div>
-          <!--Media Preparation-->
-          <div class="card">
-            <div class="card-header" id="headingMedia">
-              <h2 class="mb-0" data-toggle="collapse" data-target="#collapseMedia">
-                <div class="btn title-fontStyle" aria-expanded="true" aria-controls="collapseMedia">
-                  Media Preparation
-                </div>
-                <span class="plusClass"></span>
-                <span class="minusClass"></span>
-              </h2>
-            </div>
-            <div id="collapseMedia" class="collapse" aria-labelledby="headingMedia">
-              <div class="card-body">
-                <div class="container margin-top-small">
-                  <div class="align-font bold-font"><h3 style="font-size: 2rem;">1.LB <span style="font-size:1.5rem;">(Lysogeny Broth)</span></h3>
-                  </div>
-                  <hr class="half-hr margin-bottom">
-                  <div class="row">
-                    <div class="col">
-                      <br><br><div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Materials:</div>
-                      <p><h4>Equipment:</h4></p>
-                      <p>1. Glass bottle (for LB broth) or Erlenmeyer flask (for agar medium)</p>
-                      <p>2. Magnetic stirrer </p>
-                      <p>3. Magnetic stirring bar</p>
-                      <p>4. Plastic measure jug</p>
-                      <p>5. Measure cylinder</p>
-                      <p>6. Spoon</p>
-                      <p>7. Petri dish (for agar medium)</p>
-                      <p>8. Aluminum foil</p>
-                      <p>9. Electronic balance</p>
-                      <p>10. Weighing paper or weighing bowl</p>
-                      <p>11. Pipette and pipette tips</p>
-                      <span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Consumables:</h4></span>
-                      <p>1. DW (distilled water)</p>
-                      <p>2. Tryptone</p>
-                      <p>3. Yeast extract</p>
-                      <p>4. NaCl</p>
-                      <p>5. NaOH (10N)</p>
-                      <p>6. Agar (for LB agar)</p>
-                      <p>7. Antibiotics (for selection plate)</p>
-                    </div>
-                    <div class="col">
-                      <br><br><div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Protocol:
-                      </div>
-                      <p>1. Prepare mixture as the following inside a jar with a magnetic stirring bar inside and place it on the magnetic stirrer.</p>
-                      <div class="margin-up-bottom-m">
-                         <table class="small-table table-Border table-relative-center-align">
                            <thead>
-                             <tr>
+                             <tr style="border:3px solid #7E3B40;">
-                               <td scope="col" style="font-size: 1.1rem;">DW</th>
+                               <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">Components</th>
-                               <td style="font-size: 1.1rem;">98 ml</td>
+                               <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">Volume (μl)</th>
                              </tr>
                            </thead>
                            <tbody>
                              <tr>
-                               <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">Tryptone</th>
+                               <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">Vector DNA</th>
-                               <td style="font-size: 1.1rem;">1 g</td>
+                               <td style="font-size:1.1rem;">12</td>
                              </tr>
                              <tr>
-                               <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">Yeast Extract</th>
+                               <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">Insert DNA</th>
-                               <td style="font-size: 1.1rem;">0.5 g</td>
+                               <td style="font-size:1.1rem;">40</td>
                              </tr>
                              <tr>
-                               <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">NaCl</th>
+                               <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">Fast Ligase 2X buffer</th>
-                               <td colspan="1" style="font-size: 1.1rem;">1 g</td>
+                               <td colspan="1" style="font-size:1.1rem;">5.8</td>
                              </tr>
                              <tr>
-                               <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">NaOH (10N)</th>
+                               <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">T4 ligase</th>
-                               <td style="font-size: 1.1rem;">20 μl</td>
+                               <td style="font-size:1.1rem;">0.5</td>
                              </tr>
-                             <tr style="border:3px solid #7E3B40;border-bottom:1px;">
+                             <tr>
-                               <th scope="row" style="font-size: 1.2rem; text-align: center;">Total Volume</th>
+                               <th scope="row" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">Total Volume</th>
-                               <th style="font-size: 1.2rem; text-align: center;">100 ml</td>
+                               <th colspan="1" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">58.3</td>
-                            </tr>
-                            <tr style="border:3px solid #7E3B40; border-top:1px;">
-                              <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">Agar <span class="small-font">(for LB agar)</span></th>
-                              <td style="font-size: 1.1rem;">1.5%</td>
                              </tr>
                            </tbody>
                          </table>
-                      </div>
+                       <p>2. Gently mix the reaction and centrifuge.</p>
-                       <p>2. Mix well, pour the mixture into the bottle or flask and autoclave. Notes: For agar medium, pour the mixture to the petri dish and dry the plates.</p>
+                       <p>3. Incubate at 16°C overnight.</p>
-                       <p>For selection plates, add antibiotics as the following before pouring the mixture to the petri dish:</p>
+                       <p>4. Keep the DNA solution in -20°C freezer.</p>
-                      <p><li style="font-size: 1.1rem;">Kanamycin: 100 μl/100 ml media</p></li>
-                       <p><li style="font-size: 1.1rem;">Chloramphenicol: 50 μl/100 ml media</p></li>
-                      <p><li style="font-size: 1.1rem;">Ampicillin: 100 μl/100 μl media</p></li>
                      </div>
                    </div>
                  </div>
-                <div class="container margin-top-lg">
+              </div>
-                   <div class="align-font bold-font"><h3 style="font-size: 2rem;">2.SOB <span style="font-size:1.5rem;">(Super Optimal Broth)</span></h3></div>
+            </div>
-                  <hr class="half-hr margin-bottom">
+          </div>
-                   <div class="row">
-                     <div class="col">
+          <!--start of every card12121212-->
-                       <br><br><div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Materials:</div>
+            <div class="card">
-                      <p><h4>Equipment:</h4></p>
+              <div class="card-header" id="heading12">
-                      <p>1. Flask</p>
+                <h2 class="mb-0" id="firstOne" data-toggle="collapse" data-target="#collapse12">
-                      <p>2. Magnetic stirrer </p>
+                   <div class="btn title-fontStyle" aria-expanded="false" aria-controls="collapse12">
-                      <p>3. Magnetic stirring bar</p>
+                    Colony PCR
-                      <p>4. Plastic measure jug</p>
+                  </div>
-                      <p>5. Measure cylinder</p>
+                  <span class="plusClass"></span>
-                      <p>6. Spoon</p>
+                  <span class="minusClass"></span>
-                      <p>7. Aluminum foil</p>
+                </h2>
-                      <p>8. Electronic balance</p>
+              </div>
-                      <p>9. Weighing paper or weighing bowl</p>
+              <div id="collapse12" class="collapse" aria-labelledby="heading12">
-                      <p>10. Pipette and pipette tips</p>
+                <div class="card-body">
-                      <span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Consumables:</h4></span>
+                   <div class="container margin-top-small">
-                      <p>1. DW (distilled water)</p>
+                     <div class="row">
-                      <p>2. Tryptone</p>
+                       <div class="col">
-                      <p>3. Yeast extract</p>
+                        <div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Materials:</div>
-                      <p>4. 5M NaCl</p>
+                         <p><h4>Equipment:</h4></p>
-                      <p>5. 3M KCl</p>
+                         <p>1. PCR tubes</p>
-                    </div>
+                         <p>2. Ice</p>
-                    <div class="col">
+                         <p>3. Thermocycler</p>
-                      <br><br><div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Protocol:
+                         <p>4. Pipette and pipette tips</p>
+                         <p><span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Consumables:</h4></span></p>
+                         <p>1. MQ or ddH<sub>2</sub>O</p>
+                         <p>2. 10x PCR buffer</p>
+                         <p>3. dNTPs 2.5 mM</p>
+                         <p>4. Forward and reverse primer (10 μM)</p>
+                         <p>5. Taq polymerase with 3 μl vent</p>
+                        </p>
                        </div>
-                       <p>1. Prepare mixture as the following inside a jar with a magnetic stirring bar inside and place it on the magnetic stirrer.</p>
+                       <div class="col" style="padding-left:0;">
-                      <div class="margin-up-bottom-m">
+                        <div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Protocol:</div>
-                         <table class="small-table table-Border table-relative-center-align">
+                        <p style="margin-bottom:1rem;">1. On ice, add all components in a PCR tube, making up to 50 µl volume reaction.</p>
+                        <!--start of table-->
+                         <table class="table table-Border">
                            <thead>
-                             <tr>
+                             <tr style="border:3px solid #7E3B40;">
-                               <td scope="col" style="font-size: 1.1rem;">DW</th>
+                               <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">Components</th>
-                               <td style="font-size: 1.1rem;">96 ml</td>
+                               <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">Volume (μl)</th>
                              </tr>
                            </thead>
                            <tbody>
                              <tr>
-                               <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">Tryptone</th>
+                               <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">MQ or ddH<sub>2</sub>O</th>
-                               <td style="font-size: 1.1rem;">2 g</td>
+                               <td style="font-size:1.1rem;">1.1</td>
                              </tr>
                              <tr>
-                               <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">Yeast Extract</th>
+                               <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">10x PCR buffer</th>
-                               <td style="font-size: 1.1rem;">0.5 g</td>
+                               <td style="font-size:1.1rem;">1</td>
                              </tr>
                              <tr>
-                               <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">5M NaCl</th>
+                               <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">dNTP 2.5 mM</th>
-                               <td colspan="1" style="font-size: 1.1rem;">0.2 ml</td>
+                               <td colspan="1" style="font-size:1.1rem;">0.8</td>
                              </tr>
                              <tr>
-                               <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">3M KCL</th>
+                               <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">Template</th>
-                               <td style="font-size: 1.1rem;">83 μl</td>
+                               <td style="font-size:1.1rem;">1</td>
                              </tr>
-                             <tr style="border:3px solid #7E3B40;">
+                             <tr>
-                               <th scope="row" style="font-size: 1.2rem;">Total Volume</th>
+                               <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">Forward primer 10 μM</th>
-                               <th style="text-align: center; font-size: 1.2rem;">100 ml</th>
+                               <td style="font-size:1.1rem;">1</td>
                              </tr>
-                          </tbody>
+                             <tr>
-                        </table>
+                               <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">Reverse primer 10 μM</th>
-                      </div>
+                               <td style="font-size:1.1rem;">0.1</td>
-                      <p>2. Mix well, pour the mixture into the flask and autoclave.</p>
-                    </div>
-                  </div>
-                </div>
-                <div class="container margin-top-lg">
-                  <div class="align-font bold-font"><h3 style="font-size: 2rem;">3.SOC</h3></div>
-                  <hr class="half-hr margin-bottom">
-                  <div class="row">
-                    <div class="col">
-                      <br><br><div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Materials:</div>
-                      <p><h4>Equipment:</h4></p>
-                      <p>1. Pipette and pipette tips</p>
-                      <span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Consumables:</h4></span>
-                      <p>1. SOB medium in a glass bottle</p>
-                      <p>2. 1M MgCl<sub>2</sub></p>
-                      <p>3. 1M MgSO<sub>4</sub></p>
-                      <p>4. 20% glucose</p>
-                    </div>
-                    <div class="col">
-                      <br><br><div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Protocol:
-                      </div>
-                      <p>1. Add chemicals as the following to a bottle of 100 ml SOB (autoclaved)</p>
-                      <div class="margin-up-bottom-m">
-                        <table class="small-table table-Border table-relative-center-align">
-                          <thead>
-                             <tr>
-                               <td scope="col" style="font-size: 1.1rem;">1M M<sub>g</sub>Cl<sub>2</sub></th>
-                               <td style="font-size: 1.1rem;">96 ml</td>
                              </tr>
-                          </thead>
+                             <tr>
-                          <tbody>
+                               <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">Taq polymerase + vent</th>
-                             <tr>
+                               <td colspan="1" style="font-size:1.1rem;">0.1</td>
-                               <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">1M M<sub>g</sub>SO<sub>4</sub></th>
-                               <td style="font-size: 1.1rem;">2 g</td>
                              </tr>
                              <tr>
-                               <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">20% glucose</th>
+                               <th scope="row" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">Total Volume</th>
-                               <td style="font-size: 1.1rem;">0.5 g</td>
+                               <th colspan="1" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">10</td>
                              </tr>
                            </tbody>
                          </table>
-                      </div>
+                        <!--end of table-->
-                    </div>
+                        <p>2. Gently mix the PCR reactions and centrifuge briefly. </p>
-                  </div>
+                        <p style="margin-bottom:1rem;">3. Transfer the PCR tubes to a thermocycler.</p>
-                </div>
+                        <!--start of table-->
-                <div class="container margin-top-lg">
+                         <table class="table table-Border">
-                  <div class="align-font bold-font"><h3 style="font-size: 2rem;">4. M9 Medium</h3>
-                  </div>
-                  <hr class="half-hr margin-bottom">
-                  <div class="row">
-                    <div class="col">
-                      <br><br><div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Materials:</div>
-                      <p><h4>Equipment:</h4></p>
-                      <p>1. Pipette and pipette tips</p>
-                      <span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Consumables:</h4></span>
-                      <p>1. M9 salts (5x)</p>
-                      <p>2. 20% glucose</p>
-                      <p>3. 1M MgSO<sub>4</sub></p>
-                      <p>4. 1M CaCl<sub>2</sub></p>
-                      <p>5. H<sub>2</sub>O</p>
-                    </div>
-                    <div class="col">
-                      <br><br><div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Protocol:</div>
-                      <p>1. Add chemicals as the following to a bottle</p>
-                      <div class="margin-up-bottom-m">
-                         <table class="small-table table-Border table-relative-center-align">
                            <thead>
-                             <tr>
+                             <tr style="border:3px solid #7E3B40;">
-                               <td scope="col" style="font-size: 1.1rem;">M9 salts (5X)</th>
+                               <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">step</th>
-                               <td style="font-size: 1.1rem;">20 ml</td>
+                               <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">Temperature</th>
+                              <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">Time</th>
                              </tr>
                            </thead>
                            <tbody>
                              <tr>
-                               <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">20% glucose</th>
+                               <td scope="row" style="font-size:1.1rem; text-align: center;">Initial denaturalization</th>
-                               <td style="font-size: 1.1rem;">2 ml</td>
+                               <td style="font-size:1.1rem;">94°C</td>
+                              <td style="font-size:1.1rem;">5 mins</td>
                              </tr>
                              <tr>
-                               <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">1M M<sub>g</sub>SO<sub>4</sub></th>
+                               <td style="text-align: center;vertical-align:middle; font-size:1.1rem;" scope="row" rowspan="3" >25 - 35 cycles</th>
-                               <td style="font-size: 1.1rem;">200 μl</td>
+                              <td style="font-size:1.1rem;">94°C (denaturation)</td>
+                               <td style="font-size:1.1rem;">30 secs</td>
                              </tr>
                              <tr>
-                               <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">1M C<sub>a</sub>Cl<sub>2</sub></th>
+                               <td colspan="1" style="font-size:1.1rem;">55°C (annealing)</td>
-                               <td colspan="1" style="font-size: 1.1rem;">10 μl</td>
+                               <td style="font-size:1.1rem;">30 secs</td>
                              </tr>
                              <tr>
-                               <td scope="row" style="font-size: 1.1rem;">H<sub>2</sub>O</th>
+                               <td style="font-size:1.1rem;">72°C (Extension)</td>
-                               <td style="font-size: 1.1rem;">78 ml</td>
+                               <td style="font-size:1.1rem;">2 mins (depend on sequence size 2kbp/min.)</td>
                              </tr>
-                             <tr style="border:3px solid #7E3B40;">
+                             <tr>
-                               <th scope="row" style="font-size: 1.2rem;">Total Volume</th>
+                              <td scope="row" style="text-align:center;font-size:1.1rem;">Final Extension</th>
-                               <th style="text-align: center; font-size: 1.2rem;">100 ml</th>
+                               <td style="font-size:1.1rem;">72°C</td>
+                              <td style="font-size:1.1rem;">5 mins</td>
+                            </tr>
+                            <tr>
+                              <td scope="row" style="vertical-align:middle;text-align:center; font-size:1.1rem;">Hold</th>
+                               <td style="font-size:1.1rem;">16°C (holding for a short time) or 4°C (holding for a long time)</td>
+                              <td style="text-align: center;vertical-align: middle;font-size:1.1rem;">∞</td>
                              </tr>
                            </tbody>
                          </table>
                        </div>
-                      <p>2. Mix well, pour the mixture into the flask and autoclave.</p>
                      </div>
                    </div>
@@ Line 1,833: / Line 1,457: @@
                </div>
              </div>
-            <!--functional test-->
+         <!--start of every card13131313-->
-            <div class="card">
+           <div class="card">
-              <div class="card-header" id="headingFunction">
+            <div class="card-header" id="heading13">
-                <h2 class="mb-0" data-toggle="collapse" data-target="#collapseFunction" style="border-bottom: 2px solid brown !important;">
+              <h2 class="mb-0" data-toggle="collapse" data-target="#collapse13">
-                   <div class="btn title-fontStyle" aria-expanded="true" aria-controls="collapseFunction">
+                   <div class="btn title-fontStyle" aria-expanded="false" aria-controls="collapse13">
-                     Functional Test
+                     Bacterial Glycerol Stock
                    </div>
                    <span class="plusClass"></span>
@@ Line 1,844: / Line 1,468: @@
                  </h2>
                </div>
-               <div id="collapseFunction" class="collapse" aria-labelledby="headingFunction">
+               <div id="collapse13" class="collapse" aria-labelledby="heading13">
+                <!--start of card-body-->
                  <div class="card-body">
-                   <div class="container margin-top-lg">
+                   <div class="container margin-top-small">
-                    <div class="align-font bold-font"><h3 style="font-size: 2rem;"><i>can</i> gene kill switch functional test</h3></div>
-                    <hr class="half-hr margin-bottom">
                      <div class="row">
                        <div class="col">
-                         <br><br><div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Materials:</div>
+                         <div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Materials:</div>
+                        <!--sub sub sub title-->
                          <p><h4>Equipment:</h4></p>
-                         <p>1. CO<sub>2</sub> incubator</p>
+                         <p>1. Pipette and pipette tips</p>
-                         <p>2. Toothpick</p>
+                         <p>2. Cryovial</p>
                          <span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Consumables:</h4></span>
-                         <p>1. LB plates (can also with the desired antibiotic)</p>
+                         <p>1. 50% glycerol (autoclaved)</p>
+                        <p>2. Bacterial overnight culture with an antibiotic if necessary</p>
                        </div>
                        <div class="col">
-                         <br><br><div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Protocol:</div>
+                         <div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Protocol:</div>
-                         <p>1. Divide the plate into several parts depends on how many colonies are being tested.</p>
+                        <p>1. Put 1 ml of bacterial overnight culture into the cryovial and add 500 μl of 50% glycerol. Mix it well.</p>
-                         <p>2. Streak the plates using the toothpick.</p>
+                        <p>2. Keep it in the -80°C freezer.</p>
-                         <p>3. Grow the bacteria in the 37°C CO<sub>2</sub> incubator and normal incubator for comparison.</p>
-                      </div>
                      </div>
                    </div>
-                  <div class="container margin-top-lg">
+                </div>
-                    <div class="align-font bold-font"><h3 style="font-size: 2rem;"><i>dapA</i> gene kill switch functional test  </h3></div>
+              </div>
-                    <hr class="half-hr margin-bottom">
+            </div>
-                    <div class="row">
+          </div>
-                      <div class="col">
+         <!--start of every card14141414-->
-                        <br><br><div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Materials:</div>
+          <div class="card">
-                        <p><h4>Equipment:</h4></p>
+            <div class="card-header" id="heading14">
-                        <p>1. 37°C incubator</p>
+              <h2 class="mb-0" data-toggle="collapse" data-target="#collapse14">
-                        <p>2. Toothpick</p>
+                <div class="btn title-fontStyle" aria-expanded="true" aria-controls="collapse14">
-                        <span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Consumables:</h4></span>
+                  SDS-PAGE
-                        <p>1. LB plates (can also with the desired antibiotic)</p>
+                </div>
-                        <p>2. LB + DAP plates (concentration of DAP may vary)
+                <span class="plusClass"></span>
-                       </div>
+                <span class="minusClass"></span>
-                       <div class="col">
+              </h2>
-                        <br><br><div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Protocol:</div>
+            </div>
-                        <p>1. Divide the plates with DAP chemical and without DAP chemical into several parts depends on how many colonies are being tested.</p>
+            <div id="collapse14" class="collapse" aria-labelledby="heading14">
-                        <p>2. Streak the plates using the toothpick.</p>
+              <div class="card-body">
-                        <p>3. Grow the bacteria in the 37°C incubator.</p>
+                <div class="container margin-top-small">
-                       </div>
+                  <div class="row">
+                    <div class="col">
+                      <div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Materials:</div>
+                      <p><h4>Equipment:</h4></p>
+                      <p>1. Eppendorf tubes</p>
+                      <p>2. Pipette and pipette tips</p>
+                      <p>3. Centrifuge</p>
+                      <p>4. Vortex</p>
+                      <p>5. Ice bucket</p>
+                      <p>6. Empty box</p>
+                      <p>7. Dry Thermounit</p>
+                      <p>8. Glass plates</p>
+                      <p>9. 10-well comb</p>
+                      <p>10. Spacer</p>
+                      <p>11. Clamp</p>
+                      <p>12. Casting stand</p>
+                      <p>13. Buffer tank</p>
+                      <p>14. Voltage source</p>
+                      <p>15. Shaker</p>
+                      <p><h4>Consumables:</h4></p>
+                      <p>1. H<sub>2</sub>O</p>
+                      <p>2. 30% acrylamide</p>
+                       <p>3. 1.5M tris pH 8.8</p>
+                       <p>4. 1M tris pH 6.8</p>
+                      <p>5. 10% SDS</p>
+                      <p>6. 10% APS</p>
+                      <p>7. TEMED</p>
+                      <p>8. Prestained Protein Marker - Bioman</p>
+                      <p>9. Protein dye</p>
+                      <p>10. Overnight culture (sample)</p>
+                      <p>11. Coomassie Brilliant Blue (CBB) staining solution</p>
+                      <p>12. Destaining buffer</p>
+                       <p>13. Tank buffer (1X)</p>
+                      <p>14. Isopropanol</p>
                      </div>
-                  </div>
+                     <div class="col">
-                  <div class="container margin-top-lg">
+                       <div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Protocol:</div>
-                     <div class="align-font bold-font"><h3 style="font-size: 2rem;"><i>p</i>-Cresol Sensing Functional Test</h3></div>
+                         <p><h4>Resolving gel preparation:</h4></p>
-                    <hr class="half-hr margin-bottom">
+                         <p>1. Adjust the amount of agarose to get the desired gel concentration.</p>
-                    <div class="row">
+                         <p style="margin-bottom:1rem;">2. In a 50 ml eppendorf tube add all the components 15% gel concentration.</p>
-                       <div class="col">
+                         <table class="table table-Border">
-                        <br><br><div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Materials:</div>
+                          <thead>
-                         <p><h4>Equipment:</h4></p>
+                            <tr style="border:3px solid #7E3B40;">
-                         <p>1. 96 well-plate</p>
+                              <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">Total Volume</th>
-                         <p>2. Pipette and tips</p>
+                              <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">5 ml</th>
-                         <p>3. 37°C incubator</p>
+                              <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">10 ml</th>
-                        <p>4. Spectrofluorometer</p>
+                              <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">15 ml</th>
-                        <span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Consumables:</h4></span>
+                            </tr>
-                        <p>1. Bacterial culture</p>
+                          </thead>
-                        <p>2. <i>p</i>-Cresol</p>
+                          <tbody>
-                      </div>
+                            <tr>
-                      <div class="col">
+                              <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">H2O (ml)</th>
-                        <br><br><div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight:bold;">Protocol:</div>
+                              <td style="font-size:1.1rem;">1.15</td>
-                        <p>1. Make overnight cultures induced with different concentrations of <i>p</i>-Cresol and also without <i>p</i>-Cresol for control. Incubate at 37°C incubator.</p>
+                              <td style="font-size:1.1rem;">2.3</td>
-                        <p>2. Load 200 μl of samples onto the 96 well plates. Arrange with your personal preference.</p>
+                              <td style="font-size:1.1rem;">3.4</td>
-                        <p>3. Measure fluorescence using the spectrofluorometer.</p>
+                            </tr>
-                      </div>
+                            <tr>
-                    </div>
+                              <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">30% acrylamide mix (ml)</th>
-                  </div>
+                              <td style="font-size:1.1rem;">2.5</td>
-                  <div class="container margin-top-lg">
+                              <td style="font-size:1.1rem;">5</td>
-                    <div class="align-font bold-font"><h3 style="font-size: 2rem;">pFNR-GFP Characterization Assay</h3></div>
+                              <td style="font-size:1.1rem;">7.5</td>
-                    <hr class="half-hr margin-bottom">
+                            </tr>
-                    <div class="row">
+                            <tr>
-                      <div class="col">
+                              <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">1.5M Tris pH 8.8 (ml)</th>
-                        <br><br><div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Materials:</div>
+                              <td colspan="1" style="font-size:1.1rem;">1.25</td>
-                        <p><h4>Equipment:</h4></p>
+                              <td colspan="1" style="font-size:1.1rem;">2.5</td>
-                        <p>1. Black 96 well-plate</p>
+                              <td colspan="1" style="font-size:1.1rem;">3.3</td>
-                        <p>2. Pipette and tips</p>
+                            </tr>
-                        <p>3. 37°C incubator</p>
+                            <tr>
-                        <p>4. 37°C anaerobic incubator</p>
+                              <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">10% SDS (ml)</th>
-                        <p>5. Test tube (glass)</p>
+                              <td style="font-size:1.1rem;">0.05</td>
-                        <p>6. Cell density reader</p>
+                              <td style="font-size:1.1rem;">0.1</td>
-                        <p>7. Fluorescence reader</p>
+                              <td style="font-size:1.1rem;">0.15</td>
-                        <span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Consumables:</h4></span>
+                            </tr>
-                        <p>1. Bacterial culture (<i>E. coli</i> DH5a with pFNR-GFP and <i>E. coli</i> DH5a with pSB1C3)</p>
+                            <tr>
-                        <p>2. Eppendorf</p>
+                              <th scope="row" style="font-size:1.1rem;text-align: center;font-weight: 100;">10% APS (ml)</th>
-                        <p>3. LB medium with appropriate antibiotic</p>
+                              <th style="font-size:1.1rem;text-align: center;font-weight: 100;">0.1</td>
-                      </div>
+                              <th style="font-size:1.1rem;text-align: center;font-weight: 100;">0.2</td>
-                      <div class="col">
+                              <th style="font-size:1.1rem;text-align: center;font-weight: 100;">0.3</td>
-                        <br><br><div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight:bold;">Protocol:</div>
+                            </tr>
-                        <p>1. Grow bacterial culture with 4 ml LB and appropriate antibiotics, put it in 37°C anaerobic incubator and also normal incubator overnight. For more accurate data, make 3 cultures for every strain.</p>
+                            <tr>
-                        <p>2. Refresh all bacterial culture in 10 ml LB with appropriate antibiotics.</p>
+                              <th scope="row" style="font-size:1.1remtext-align: center;font-weight: 100;;">TEMED (ml)</th>
-                        <p>3. Take 1 ml bacterial culture into Eppendorf every 2 hours for measurement.</p>
+                              <th style="font-size:1.1rem;text-align: center;font-weight: 100;">0.002</td>
-                        <p>4. Add 200 μl of bacterial culture to the 96-well plate. Set up the fluorescence reader (in our case, wtgfp: excitation-395 nm, emission-509 nm) and measure the fluorescence.</p>
+                              <th style="font-size:1.1rem;text-align: center;font-weight: 100;">0.004</td>
-                      </div>
+                              <th style="font-size:1.1rem;text-align: center;font-weight: 100;">0.006</td>
-                    </div>
+                            </tr>
-                  </div>
+                          </tbody>
-                  <div class="container margin-top-lg">
+                        </table>
-                    <div class="align-font bold-font"><h3 style="font-size: 2rem;">Spot on Lawn Assay</h3></div>
+                         <p>3. Pour the mixture in between the glasses and add iso-propanol afterward.</p>
-                    <hr class="half-hr margin-bottom">
+                         <p>4. Wait for 10-15 mins or until the gel solidifies.</p>
-                    <div class="row">
+                         <p>5. Pour out the iso-propanol.</p>
-                      <div class="col">
+                         <p><span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Stacking gel preparation:</h4></span></p>
-                        <br><br><div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Materials:</div>
+                         <p style="margin-bottom:1rem;">1. In a 50 ml eppendorf tube add all the components.</p>
-                        <p><h4>Equipment:</h4></p>
+                         <table class="table table-Border">
-                         <p>1. Pipette and tips</p>
+                          <thead>
-                         <p>2. -80°C fridge</p>
+                            <tr style="border:3px solid #7E3B40;">
-                         <p>3. 37°C anaerobic incubator</p>
+                              <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">Total Volume</th>
-                         <span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Consumables:</h4></span>
+                              <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">1.5 ml</th>
-                        <p>1. Bacterial culture</p>
+                              <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">3 ml</th>
-                         <p>2. BHI plate</p>
+                              <th scope="col" style="font-size:1.2rem; text-align: center;">5 ml</th>
-                         <p>3. 0.22 μm filter</p>
+                            </tr>
-                        <p>4. Purified bacteriocin (positive control)</p>
+                          </thead>
-                        <p>5. LB medium</p>
+                          <tbody>
-                      </div>
+                            <tr>
-                      <div class="col">
+                              <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">H2O (ml)</th>
-                        <br><br><div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Protocol:</div>
+                              <td style="font-size:1.1rem;">1.05</td>
-                        <p>1. Grow overnight cultures of <i>c. difficile</i> and bacteria carrying plasmid with bacteriocin in 6 ml LB.<class="small-font bold-font">(Note: In this experiment, total cell lysate and filtered growth medium of the culture carrying plasmid with bacteriocin will be used to test both the expression and secretion of bacteriocin.)</p>
+                              <td style="font-size:1.1rem;">2.1</td>
-                        <p>2. Take 100 μl of the <i>c. difficile</i> overnight culture and streak evenly on the dried BHI plate. </p>
+                              <td style="font-size:1.1rem;">3.4</td>
-                        <p>3. To test the secretion ability of bacteriocin, take 2 ml overnight culture of bacteriocin producing bacteria and filter it through a 0.22 μm filter. Spot 5 μl of the filtered solution on the streaked BHI plate.</p>
+                            </tr>
-                        <p>4. To test the expression of bacteriocin, take 2 ml overnight culture of bacteriocin producing bacteria and put it in -80°C fridge. Freeze for 10 min and take the frozen bacteria back to the room temperature to unfroze it. Repeat this step twice. Then, take the culture solution and filter it through a 0.22 μm filter and spot 5 μl of the filtered solution on the streaked BHI plate.</p>
+                            <tr>
-                        <p>5. For positive control, purified bacteriocin without yebF secretion tag kindly proved by one of the PI’s lab are used.</p>
+                              <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">30% acrylamide mix (ml)</th>
-                        <p>6. Grow the plate in the anaerobic incubator and observe the inhibition zone.</p>
+                              <td style="font-size:1.1rem;">0.25</td>
-                      </div>
+                              <td style="font-size:1.1rem;">0.5</td>
-                    </div>
+                              <td style="font-size:1.1rem;">0.83</td>
-                  </div>
+                            </tr>
-                  <div class="container margin-top-lg">
+                            <tr>
-                    <div class="align-font bold-font"><h3 style="font-size: 2rem;">TAL Functional Test</h3></div>
+                              <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">1M Tris pH 6.8 (ml)</th>
-                    <hr class="half-hr margin-bottom">
+                              <td colspan="1" style="font-size:1.1rem;">0.19</td>
-                    <div class="row">
+                              <td colspan="1" style="font-size:1.1rem;">0.38</td>
-                      <div class="col">
+                              <td colspan="1" style="font-size:1.1rem;">0.63</td>
-                        <br><br><div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Materials:</div>
+                            </tr>
-                        <p><h4>Equipment:</h4></p>
+                            <tr>
-                        <p>1. 37°C anaerobic incubator</p>
+                              <td scope="row" style="font-size:1.1rem;">10% SDS (ml)</th>
-                        <p>2. Pipette and tips</p>
+                              <td style="font-size:1.1rem;">0.015</td>
-                        <p>3. Spectrophotometer <span class="small-font">(NanoDrop)</span></p>
+                              <td style="font-size:1.1rem;">0.03</td>
-                        <span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Consumables:</h4></span>
+                              <td style="font-size:1.1rem;">0.05</td>
-                        <p>Bacterial culture</p>
+                            </tr>
-                        <p>1. <i>n</i>-octanol</p>
+                            <tr>
-                        <p>2. LB</p>
+                              <th scope="row" style="font-size:1.1rem;text-align: center;font-weight: 100;">10% APS (ml)</th>
-                        <p>3. LB + 2 mM tyrosine</p>
+                              <th style="font-size:1.1rem;text-align: center;font-weight: 100;">0.03</td>
-                        <p>4. LB + 1 mM tyrosine</p>
+                              <th style="font-size:1.1rem;text-align: center;font-weight: 100;">0.06</td>
-                         <p>5. LB + 500 μM tyrosine</p>
+                              <th style="font-size:1.1rem;text-align: center;font-weight: 100;">0.05</td>
-                         <p>6. <i>p</i>-Coumaric acid</p>
+                            </tr>
-                         <p>7. Lysis buffer</p>
+                            <tr>
-                         <p>8. Neutralization buffer</p>
+                              <th scope="row" style="font-size:1.1rem;text-align: center;font-weight: 100;">TEMED (ml)</th>
-                      </div>
+                              <th style="font-size:1.1rem;text-align: center;font-weight: 100;">0.0015</td>
-                      <div class="col">
+                              <th style="font-size:1.1rem;text-align: center;font-weight: 100;">0.003</td>
-                        <br><br><div style="font-size: 2rem; text-align: center;margin-bottom: 1rem; font-weight: bold;">Protocol:</div>
+                              <th style="font-size:1.1rem;text-align: center;font-weight: 100;">0.005</td>
-                        <h5 class="bold-font"><i>p</i>-Coumaric acid fermentation:</h5>
+                            </tr>
-                         <p>1. For each <i>E.coli</i> strain, bacterial colony is inoculate to 6 ml LB medium containing appropriate antibiotic and grow overnight in normal 37°C incubator.</p>
+                          </tbody>
-                         <p>2. Incubate for 16 hours.</p>
+                         </table>
-                         <p>3. Take 60 μl of bacterial culture to refresh in 6 ml LB containing containing appropriate antibiotic and different concentration of tyrosine.</p>
+                         <p>2. Pour the mixture in between the glass plates and add the 10-well comb.</p>
-                         <p>4. Incubate the refreshed cell culture in anaerobic incubator at 37°C.</p>
+                         <p>3. Wait for 10-15 mins or until the gel solidifies.</p>
-                         <p>5. Samples are collected in the 24- and 48- hour, after the initiation of the anaerobic 37°C incubation.</p>
+                         <p><span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Sample preparation:</h4></span></p>
-                         <h5 class="bold-font">Sample collection:</h5>
+                         <p>1. Take overnight cultures with the desired volume and centrifuge.</p>
-                         <p>1. 250 μl of samples are collected at the 2 particular times stated above.</p>
+                         <p>2. Take 12 μl of pellet or supernatant (depends on necessity) and move to a new fresh eppendorf.</p>
-                         <p>2. The positive control is prepared by collecting 225 μl of negative control (Wild-type strain) culture with 25 μl of 500 μM, 250 μM and 50 μM of <i>p</i>-Coumaric acid in LB to create a bacterial culture with <i>p</i>-Coumaric acid concentration of 50 μM, 25 μM and 5 μM.</p>
+                         <p>3. Add 3 μl dye into the eppendorf. Vortex and centrifuge briefly.</p>
-                         <h5 class="bold-font">Sample Extraction:</h5>
+                         <p>4. Heat the eppendorf at 100°C for 10 mins and centrifuge briefly.</p>
-                         <p>1. Directly after sample collection, the samples are lysed with 25 μl of Lysis buffer (PD2) and neutralized with 43.5 μl neutralization buffer (PD3). (Thermo plasmid MiniPrep)</p>
+                         <p>5. Put samples in the ice bucket.</p>
-                         <p>2. All samples are acidified in 12.5 μl concentrated acetic acid and vortexed.</p>
+                         <p><span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Gel running:</h4></span></p>
-                         <p>3. Samples are then induced with 50 μl <i>n</i>-octanol (the organic phase in two-phase extraction).</p>
+                         <p>1. When the gel solidified, set up the running equipment and pour 1X tank buffer.</p>
-                         <p>4. Vortexing and centrifugation (>12000 g, 1 min) followed and the upper organic phase is collected for measurement.</p>
+                         <p>2. Take out the comb and load 3 μl of the marker into a well and load the samples into the remaining wells.</p>
-                        <h5 class="bold-font">Measurement:</h5>
+                        <p>3. Run the first 30 mins at 120V then continue to run for 1 hour at 150 V. Note: voltage and time may vary.</p>
-                        <p>1. The absorbance in the UV-spectrum (190 nm-350 nm) of the octanol extracts is measured in a spectrophotometer (NanoDrop).</p>
+                         <p><span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Staining:</h4></span></p>
-                         <p>2. The spectrophotometer blanked by pure <i>n</i>-octanol.</p>
+                         <p>1. Take out the glass plates out of the buffer tank and split up the glass plates to take out the gel.</p>
-                         <p>3. All measurements are done on 2 μl of extractant.</p>
+                         <p>2. The stacking gel and put the resolving gel inside an empty box, then add the CBB staining solution until it covers the gel.</p>
-                         <p>4. Absorbance measurements are done in the same way on the standards of <i>p</i>-Coumaric acid in octanol prepared from solid <i>p</i>-Coumaric acid.</p>
+                         <p>3. Put the box on a shaker and shake for 30 mins or until the gel turns blue.</p>
-                      </div>
+                         <p><span style="font-size: 1rem;font-weight: bold;"><h4>Destaining:</h4></span></p>
+                         <p>1. Pour the CBB staining solution back into the bottle and add the destaining buffer into the box until it covers the gel.</p>
+                         <p>2. Put the box on a shaker and shake until the protein bands are visible or until the gel turns white.</p>
+                         <p>3. Pour out the destaining buffer.</p>
                      </div>
                    </div>
@@ Line 2,014: / Line 1,674: @@
                </div>
              </div>
+          </div>
            </div>
            <div class="color-block">&emsp;</div>

Difference between revisions of "Team:NCKU Tainan/Experiments"

Latest revision as of 18:59, 27 October 2020

Experiments

The details about our experimental protocols

This page is about our protocols, you can find all the experimental process you need. Enjoy!

Congo red Assay

Equipment:

Consumables:

Biofilm Assay

Equipment:

Consumables:

NOS Kinetic Test

Equipment:

Consumables:

Preparation:

NOS assay:

IPTG Induce NOS Test

Equipment:

Consumables:

Preparation:

NOS assay kit:

LB Preparation

Equipment:

Consumables:

Competent Cell Preparation

Equipment:

Consumables:

Culture bacteria for making competent cell:

Test O.D. value & make competent cell:

Standard PCR

Equipment:

Consumables:

PCR Clean-up

Equipment:

Consumables:

DNA binding:

Wash

DNA elution

Restriction Enzyme Digestion

Equipment:

Consumables:

Gel Extraction and Purification

Equipment:

Consumables:

Gel excision, solubilization and DNA binding:

2. Wash:

3. DNA elution:

Ligation

Equipment:

Consumables:

Colony PCR

Equipment:

Consumables:

Bacterial Glycerol Stock

Equipment:

Consumables:

SDS-PAGE

Equipment:

Consumables:

Resolving gel preparation:

Stacking gel preparation:

Sample preparation:

Gel running:

Staining:

Destaining:

This page is about our protocols, you can find all the experimental process you need.
Enjoy!