Proof of Concept

Day 1 诱导培养 1. 取500 μL含抗生素的LB培养液，挑取平板上生长状态良好的克隆至其中，37℃摇动培养5~7 h至菌液浑浊； 2. 取3 mL含抗生素的LB培养液，加入iPTG储液至终浓度为2 mM，加入上述菌液3 μL（1:1000稀释），37℃摇动培养过夜。 Day 2 冻干 1. 观察对照组（GFP）是否产生荧光，观察到荧光后，方可继续进行实验； 2. 使用分光光度计测定菌液OD600值，以OD600 = 1为109细胞，OD600在0.1~1之间，OD600值与细菌密度成线性关系，计算109个细胞所需取的菌液体积V = 100 / (OD600 × 稀释倍数) ； 3. 取109细胞，8000 rpm离心3 min，尽弃上清； 4. 使用预冷的100 μL 3%葡萄糖水溶液重悬菌体至15 mL摇菌管； 5. 取下摇菌管盖，将样品放入冷阱，打开冻干仪的压缩机，冷冻2 h（期间冷阱温度低至-70℃）； 6. 将样品提起，打开真空泵和真空计，真空干燥6 h（期间真空度低至1 Pa）； 7. 关闭真空泵，盖紧管盖，室温放置2天。 Day 4 存活率检测 1. 向上述摇菌管中加入1 mL无菌水，涡旋15 s，室温静置10 min； 2. 弹匀，取100 μL菌液（含108细胞）涂板； 3. 若以上密度不合适，则进行数次梯度稀释后再取100 μL涂板； 4. 37℃倒置、静置培养过夜。 Day 5 细胞计数 1. 取出平板，拍照记录实验结果； 2. 使用Image J软件的细胞自动计数功能统计各平板菌落数，对比各组结果。